空间环境诱导屎肠球菌突变株LCT-EF18的蛋白组学分析

目的 对搭载神舟八号飞船的屎肠球菌进行突变株筛选,并鉴定和分析差异表达的蛋白质。方法 利用Biolog 生化反应板从搭载神舟八号飞船飞行后屎肠球菌中筛选突变株,提取突变株蛋白质并进行SDS-PAGE 电泳检测,用BCA 法测定总蛋白浓度后,采用同重同位素相对与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ） 方法分析空间环境诱变屎肠球菌突变株和地面对照株之间的差异表达蛋白,并进行统计、分析和注释。结果 通过Biolog 表型筛选获得空间环境诱导屎肠球菌突变株LCT-EF20,该菌株能利用肌酐和L- 苹果酸,而不能利用对羟基苯乙酸。差异蛋白组学分析发现了124 个蛋白质表达的改变,其中50 个蛋白表达上调,74 个蛋白表达下调。结论 太空环境可改变屎肠球菌的生物学特性,并影响大量蛋白质的表达,差异表达蛋白主要分布在代谢相关过程。     

肺炎克雷伯菌突变株的分离和全转录组分析

目的 筛选空间环境诱变的肺炎克雷伯菌突变株及并进行全转录组分析.方法 利用Biolog生化反应板从搭载于神舟八号飞船的肺炎克雷伯菌中筛选突变株,然后采用高通量测序技术对突变株全转录组测序,原始测序数据经处理后进行基因表达注释和差异表达基因的基因本体功能及京都基因与基因组信号通路注释分析.结果 空间搭载的肺炎克雷伯菌突变株在糖类代谢上出现差异,且该菌株有232个基因表达上调,1 879个基因下调,其主要同细菌的膜蛋白、转运相关功能、糖类的运输相关.结论 获得一株空间环境诱导的肺炎克雷伯菌突变株且该菌株全转录组测序和注释清晰,为后续的功能研究奠定了基础.     

空间诱导蜡状芽孢杆菌LCT-BC25和LCT-BC235的蛋白质组学研究

目的 探索空间环境对蜡状芽孢杆菌的影响。 方法 采用同重同位素相对与绝对定量（isobaric tags for relativeand absolute quantitation,iTRAQ） 技术对经空间诱变蜡状芽孢杆菌LCT-BC25 和LCT-BC235 以及地面对照株LCT-BC244 进行蛋白质组质谱检测,对测得的肽段重新组装,对组装的蛋白进行功能注释分析,最终筛选具有明显表达差异的蛋白质。 结果 本研究共鉴定到1 269 个可能蛋白质,根据蛋白相邻类的聚簇（cluster of orthologous groups of proteins,COG）、基因本体论（gene ontology,GO）、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG） 对这些蛋白质进行分类分析发现,大多数鉴定到的蛋白与细菌代谢相关。比较蛋白质组学结果表明,空间诱变株LCT-BC25 与地面对照株LCT-BC244 比较,有57 个蛋白上调,77 个蛋白下调;空间诱变株LCT-BC235 与地面对照株LCT-BC244 比较,有8 个蛋白上调,73 个蛋白下调。 结论 空间环境对蜡状芽孢杆菌的影响具有不定向性,溶血性肠毒素蛋白明显高表达。     

人耐药肺腺癌A549/DDP细胞株的差异蛋白质组学

目的：建立A549与A549/DDP两组细胞株的双向凝胶电泳图谱,识别并鉴定其差异表达的蛋白质,筛选肺腺癌耐药相关蛋白质。方法：收集A549与A549/DDP两组细胞株的总蛋白质,应用二维凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）进行分离应用,图像分析识别差异表达的蛋白质点,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白质点。使用Western免疫印迹对其中4个蛋白质进行验证。结果：建立了A549与A549/DDP细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了40个差异表达的蛋白质点,鉴定了23个差异表达蛋白质。Western免疫印迹证实了差异蛋白质热休克蛋白β1,膜联蛋白A4,丝切蛋白l和波形蛋白在A549与A549/DDP细胞中的差异表达水平。结论：23个差异表达蛋白质为研究肺腺癌耐药机制提供了实验依据。     

转Bt基因大米与相应亲本大米差异蛋白质组学研究

目的：利用差异蛋白质组学及生物信息学等技术方法,探讨外源Bt基因的导入对大米表达蛋白质组的影响,深化转基因大米在蛋白质组学方面的研究。方法在转基因大米“华恢1号”和亲本大米“明恢63”样品中提取大米总蛋白,通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）实验方法,得到相应的蛋白质组2D-PAGE谱,再选择差异明显的蛋白质点进行质谱鉴定及生物信息学分析。结果对转Bt（cry1Ab/1Ac）基因大米和亲本大米2D-PAGE图谱的蛋白质点进行了对比匹配,识别出明显的差异蛋白质点28个,以亲本大米为参照,转Bt基因大米相对高表达的18个,相对低表达的10个;选择转基因大米凝胶上的差异蛋白质点进行了质谱鉴定和生物信息学检索,发现差异蛋白质主要参与能量代谢,蛋白质合成、氧化还原和应激响应等生物过程。结论转Bt基因“华恢1号”及其亲本大米“明恢63”表达的蛋白质组存在一定差异,但未发现这些差异蛋白质具有抗营养性和致敏性,也未发现新蛋白和毒蛋白的表达。     

肺癌性与结核性胸腔积液蛋白质组的差异

目的：建立肺癌性胸腔积液与结核性胸腔积液的双向电泳图谱,分析二者蛋白质表达的差异和特点。方法：以固相pH梯度等电聚焦为第一向,垂直板SDS-PAGE为第二向分离胸水蛋白质,银染显色,扫描仪获取凝胶图像并对其进行软件分析。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定差异蛋白质。结果：双向电泳结果显示,肺癌性胸腔积液中表达增高2倍的差异蛋白点52个,降低50%的蛋白质点60个。有9个点仅在结核性胸腔积液表达,11个点仅在肺癌胸腔积液中表达,并通过肽指纹图分析成功鉴定了6个蛋白质。结论：肺癌性胸腔积液组与结核性胸腔积液组的双向电泳结果显示蛋白表达图谱有明显差异,这些差异蛋白可能是肺癌相关蛋白或肺癌特异性蛋白标志物。     

重组人干扰素α1b空间诱变菌种初步筛选研究

目的 利用“神舟八号”飞船对表达重组人干扰素α1b 的基因工程菌株进行空间诱变，通过菌种筛选，获得高表达目的产物的菌株。方法 对重组人干扰素α1b 空间搭载菌种进行平板分离、抗性平板初筛和试管复筛，进行诱导表达，通过2 轮SDS-PAGE 分析获取高产菌株。结果 首先从300 个克隆中筛出221 株阳性克隆，再从194 个表达重组人干扰素α1b 单克隆中筛选到144 株具有氨苄青霉素抗性的克隆；通过等量接种和小量试管表达，最终筛选到6 株目的蛋白表达量和表达比例较高的克隆。结论 通过初步筛选，获得6 株空间诱变后较高表达的重组人干扰素α1b 生物工程菌菌株。     

吗啡成瘾和正常大鼠前额叶皮质差异表达蛋白的比较研究

目的：比较吗啡成瘾与正常大鼠前额叶皮质（prefrontal cortex,PFC）蛋白质双向电泳图谱,寻找和鉴定吗啡成瘾大鼠PFC中的差异表达蛋白质。方法：以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS-PAGE为第二向,分别对正常对照大鼠和吗啡成瘾大鼠的PFC蛋白质样品进行二维分离,2-DE图谱经ImageMaster 2D Platinum v5.0软件分析,选取4个差异蛋白点用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行鉴定。结果：通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,与吗啡成瘾相关的差异表达蛋白斑点为87个;经质谱鉴定出2个有意义的差异表达的蛋白斑点：snap25亚型β-snap25突触相关蛋白25、核不均一核糖核蛋白U。结论：吗啡成瘾组与正常对照组大鼠PFC蛋白质组存在差异;初步鉴定出了2种大鼠前额叶皮质中与吗啡成瘾相关的差异蛋白,其表达的变化可能通过多种途径影响PFC神经元功能,为研究阿片类物质依赖作用机制提出了新的思路和方向。     

常见舌苔蛋白质组学与生物信息学研究

目的运用蛋白质组学技术探讨不同舌苔的差异表达蛋白质。方法将观察对象根据有无各系统器质性疾病及舌苔表现,分为正常薄苔组、病理薄苔组、厚苔组和剥苔组,以固相pH梯度等电聚焦为第一相、垂直SDS-PAGE为第二相进行双向电泳,银染显色,计算机扫描,Image Master2D Platinum软件分析;选择差异点胶内胰酶消化后,进行MALDL-TOF-MS蛋白质质谱鉴定和生物信息学分析。结果四组舌苔组织可检测的蛋白质斑点数分别为（1 082±105）个、（1 052±85）个、（1 129±98）个、（1 143±140）个。差异蛋白质点肽质指纹的质谱鉴定和分析生物信息学分析结果,鉴定出13个舌苔密切相关蛋白质,其中cystatin B、cytokeratin 13和GAL7 protein为首次发现的舌苔变化相关蛋白,与舌苔发生发展的关系密切;并发现了5个新的舌苔相关未知蛋白,在目前国际蛋白质数据库中无收载,有必要进一步深入研究。结论不同病理舌苔与正常舌苔的蛋白质表达谱存在明显差异。     

非酒精性脂肪性肝病患者的肝组织差异蛋白的定量分析:基于iTRAQ技术

目的 应用蛋白质组学在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝脏组织中筛选差异蛋白,寻找关键的作用靶点。方法 收集符合纳入标准的肝脏组织,通过 HE 染色病理切片筛选出非酒精性脂肪性肝炎样本（NASH组）3例和正常对照样本3例。提取NASH组及正常对照组的肝脏蛋白,使用iTRAQ试剂对多肽进行标记进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测,用蛋白质鉴定软件Mascot2.3.02比对UniProt蛋白数据库搜索鉴定,应用GO数据库对差异表达蛋白质进行注释和富集,应用KEGG数据库进行差异蛋白质涉及信号通路富集。实时荧光定量PCR（qPCR）检测显著差异表达蛋白对应的mRNA表达水平。结果 NASH组和对照组相比,以差异倍数（>1.2或<0.8）且P<0.05为阈值质谱分析鉴定到648个显著差异蛋白,其中表达量上调的蛋白有246种,下调的蛋白有402种。GO功能富集分析结果显示,差异表达蛋白主要参与小分子代谢、有机酸代谢、含氧酸代谢等生物学过程,在代谢途径、补体凝血级联、核糖体等KEGG通路上富集。荧光定量PCR对差异倍数（>2.0或<0.5）且P<0.05的25个显著差异表达蛋白进行筛选,共有6个蛋白与蛋白组学的结果趋势一致,包括5个下调蛋白：Jumonji 蛋白（JARID2）、莱伯西林样蛋白（LCA5L）、突触素1（SYN1）及胶原α-1（XIII）链（COL13A1）、FYVE,RhoGEF和PH结构域蛋白5（FGD5）,以及1个上调蛋白：谷胱甘肽S-转移酶Mu 4（GSTM4）。结论 iTRAQ技术和生物信息学方法在NASH肝脏组织筛选出差异表达蛋白648个,其中JARID2、SYN1、COL13A1、FGD5、GSTM4可能是NASH的关键靶向蛋白。     

宫颈永生化细胞和癌细胞胞膜差异蛋白质组学研究

目的建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞（H8细胞株）和宫颈癌细胞（CaSKi细胞株）胞膜蛋白双向电泳图谱,寻找特征性的差异蛋白点。方法提取两种细胞胞膜蛋白质进行双向凝胶电泳（2-dimensronal gel electrophore-sis,2-DE）,建立电泳图谱,然后筛选出差异点进行基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption/i-onization time-of-flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF-MS/MS）分析,鉴定出蛋白质。结果获得了分辨率和重复性均较好胞膜蛋白2-DE图谱,并分析找出了13个的差异蛋白点,对其中3个显著差异点进行质谱分析和初步鉴定。结论建立了H8和Caski细胞胞膜蛋白2DE图谱,并初步发现LRC8D、EDAR、MTX1蛋白在宫颈癌前病变和宫颈癌细胞胞膜中存在差异表达,为宫颈癌及癌前病变的诊断及癌变机制提供了帮助。     

重症急性胰腺炎患者血清差异蛋白质的表达

目的：用蛋白质组学技术比较重症急性胰腺炎（SAP）与轻症急性胰腺炎（MAP）患者血清的差异蛋白,探讨SAP特异蛋白的表达。方法：血清标本取自10例急性胰腺炎（AP）患者,其中5例SAP,5例MAP,用双向凝胶电泳检测两类患者的蛋白表达,并将这些差异表达蛋白点进行质谱鉴定,Mascot数据库检索。结果：比较双向电泳图谱发现15个差异表达蛋白点,经质谱分析,成功鉴定出10种蛋白质,在SAP患者其中4种表达上调,6种表达下调。数据库查询结果,4个表达上调蛋白分别为补体4A、结合珠蛋白亚型2、结合珠蛋白和载脂蛋白L1;6个表达下调蛋白分别为四连接素、谷胱甘肽过氧化物酶3、丝氨酸蛋白酶抑制剂亚型F1、丛生蛋白亚型-1、转甲状腺素蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A1亚型2。结论：SAP患者血清有差异蛋白质表达,这可能和SAP发病机制相关。     

SERPINE1在结直肠癌中的表达及其预后意义

目的 通过生物信息学鉴定结直肠癌的差异表达基因，并研究候选基因在结直肠癌中表达情况以及其病理特征和预后意义。 方法 通过分析来自GEO数据库的基因表达数据集来鉴定结直肠癌中的差异表达基因，构建蛋白互作网络，找到核心蛋白，进行基因集富集分析，明确蛋白作用通路，通过免疫组织化学检测结直肠癌组织及正常组织中核心蛋白表达水平，生存分析进一步明确核心基因与结直肠癌的预后关系。 结果 通过筛选标准鉴定出89个差异表达基因，构建蛋白互相作用网络筛选出核心基因SERPINE1，基因富集分析表明SERPINE1表达与炎症反应及血管生成有关。SERPINE1的高表达与结直肠癌的浸润深度（P=0012），淋巴结转移（P=0025），远处转移（P=0040）和TNM分期（P=0016）显著相关。生存分析显示SERPINE1的高表达与结直肠癌的整体生存期较差有关（P=0002）。 结论 SERPINE1可能是结直肠癌发展过程中的致癌基因，SERPINE1高表达是结直肠癌预后不良的因素。     

人结肠癌与结肠腺瘤的定量蛋白质组学研究

目的 研究结肠癌（CC）与结肠腺瘤性息肉（CAP）组织差异定量表达蛋白质谱.方法 激光捕获显微切割（LCM）技术分别获取结肠癌及结肠腺瘤性息肉组织上皮细胞,应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）及纳米液相色谱-串联质谱（NanoLC-MS/MS）技术分离鉴定CC和CAP的差异表达蛋白质,并用生物信息学方法对差异蛋白质在结肠癌变过程中的生物学意义进行分析.结果 共鉴定266个差异蛋白质,其中103个蛋白质在CC上调,163个蛋白质下调,这些差异蛋白质涉及细胞代谢,免疫,运输,发育,细胞黏附,细胞周期,凋亡等过程.结论 上述差异蛋白质的鉴定为结肠癌癌变机制的研究及分子标志物确定提供了有益的科学依据.     

从脓汁中分离出沙雷氏菌

从2例患者的脓汁中分离出2株沙雷氏菌。经生化反应鉴定,其中1株为粘质沙雷氏菌;另一株未能定种,其原因是做的生化反应尚不很全面,另一原因是目前国际上对此属各个种的描述尚不详细,也可能是此株沙雷氏菌是过去未报道的新种。     

平肝潜阳方治疗前后高血压病肝阳上亢证大鼠肾上腺组织蛋白表达变化的蛋白质组学研究

目的：从蛋白质组学水平探讨大鼠高血压肝阳上亢证发生机制及平肝潜阳方治疗肝阳上亢证的分子机制，为治疗高血压肝阳上亢证寻找新的药物标志蛋白提供理论和实验依据。 方法：以自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rat，SHR）加灌服附子汤法制备高血压肝阳上亢证大鼠模型，二维凝胶电泳分离大鼠肾上腺蛋白质，获得差异表达蛋白质；利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）和数据库分析鉴定差异表达蛋白质。 结果：高血压肝阳上亢证大鼠模型复制成功，平肝潜阳法治疗后易激惹程度和结膜充血减轻，收缩压下降（P〈0．05，P〈0．01）。通过点检测后，发现12个具有明显表达差异的蛋白质斑点，经鉴定可以确认的蛋白质点有8个，其中2个蛋白点为同一蛋白。其中异柠檬酸脱氢酶、类固醇合成急性调节蛋白在模型组表达较正常组上调，在治疗组重新下调至前水平；铁轻链蛋白、Tu翻译延长因子、鸟苷酸解离抑制因子、黄素还原酶、Basic转录因子3在模型组表达较正常组下调。在治疗组重新上调至前水平。 结论：成功鉴定了高血压肝阳上亢证大鼠平肝潜阳方治疗前后肾上腺组织差异表达蛋白，为深入研究高血压病肝阳上亢证的病理机制及平肝潜阳方治疗的分子机制奠定了基础。     

HSP27在左侧结肠癌和右侧结肠癌差异表达的实验研究

目的：应用蛋白质组学技术筛选左侧结肠癌和右侧结肠癌组织中差异表达的蛋白,为左侧结肠癌（1eft sided coloncan cer,LSCC）和右侧结肠癌（right sided colon cancer,RSCC）在肿瘤生物学方面的差异提供分子遗传学依据。方法：收集人LSCC和RSCC组织标本,置-80℃超低温冰箱中保存。应用双向凝胶电泳、质谱分析和生物信息学分离和鉴定LSCC和RSCC中差异表达的蛋白质。应用RT—PCR,Western印迹和免疫组织化学技术检测差异表达蛋白的表达状态。结果：筛选出55个差异蛋白质点,成功鉴定出21种差异蛋白质。与RSCC比较,14种蛋白在LSCC表达上调,7种蛋白在LSCC表达下调,其中LSCC中HsP27表达下调。通过RT—PCR,Western印迹和免疫组织化学方法证实：在mRNA和蛋白水平,LSCC中HSP27的表达均低于RSCC。结论：LSCC和RSCC的蛋白质组存在差异表达,特别是HSP27在mRNA和蛋白水平均存在差异,这些可能是LSCC和RSCC生物学行为差异的分子遗传学基础。     

clpE缺陷对肺炎球菌蛋白表达的影响

目的 了解ClpE对肺炎球菌蛋白表达的影响.方法 用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpE基因,用PCR、测序鉴定缺陷菌株;通过固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE)分别分离野生菌和clpE缺陷菌的总蛋白质;经凝胶银染色、PDQuest 2DE软件分析获得 2个菌株的蛋白质表达谱;选取差异蛋白质点进行MEDLI-TOF质谱分析,查询数据库,获取有意义的蛋白点.结果 以肺炎链球菌D39的图谱为参考,△clpE与其匹配率为61%.挑选17个有明显差异表达的蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析,获得了17张肽质量指纹图,经数据库查询后,4个蛋白点获得了有意义的结果,分别为:次黄嘌呤鸟嘌呤核糖核酸转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase),吡咯烷羧酸肽酶(pyrrolidone-carboxylate peptidasel),甲酸四氢叶酸连接酶(formate-tetrahydrofolate ligase)和双功能蛋白pyrR (bifunctional protein pyrR).结论 野生菌表达蛋白的种类和数量均高于突变菌株,提示clpE可通过影响某些特殊蛋白质的表达,帮助细菌适应宿主的不同环境,使宿主致病.

Abstract：

Objective To investigate the effect of ClpE on the protein expression profiles of Streptococcus pneumoniae.Methods clpE-deficient Streptococcus pneumoniae strain was constructed by long flanking homology-polymerase chain reaction (LFH-PCR) and identified by PCR and sequencing. The total bacterial proteins were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis and imaging analysis, and the differentially expressed protein spots were excised by dot-gel digestion with trypsin. Peptide mass fingerprinting (PMF) was obtained by analysis of the fragment length by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The PMF was analyzed using software to identify the proteins. Results The number of matched protein spots of the two gels was 61%. By sequence database searching, 4 out of the 17 differential protein spots were identified, namely hypoxanthine-guanine, pyrrolidone-carboxylate peptidasel,formate-tetrahydrofolate ligase, and bifunctional protein pyrR. Conclusion clpE gene-deficient Streptococcus pneumoniae expresses fewer kinds of proteins at also lower levels than the wild-type bacteria, suggesting that ClpE allows the bacteria to adapt to different host environments by inducing the expression of special proteins.