大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。     

小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测

目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。     

编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建Nogo受体(NgR)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行缺血性脑损伤的基因治疗研究奠定基础.方法:将前期构建的大鼠Nogo受体mRNA的shRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含NgR基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌.将pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Adeno-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、PCR产物测序及病毒滴度测定.结果:结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后的PCR及DNA测序结果证明Adeno-U6-shRNA包被成功.结论:成功构建了大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体Adeno-U6-shRNA,将为应用基因沉默技术研究NgR在缺血性脑损伤后神经再生中的作用奠定基础.     

构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体

目的构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体,为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础。方法将前期构建的PTENshRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含PTEN基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌。pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定及Westernblotting检测受感染海马神经元细胞内PTEN蛋白的表达。结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-U6-shRNA包被成功,受腺病毒感染海马神经元细胞内PTEN蛋白表达明显降低。结论成功构建了PTEN基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-shRNA,为应用基因沉默技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定了基础。     

HDAC2基因RNA干扰载体的构建

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)基因RNA慢病毒干扰质粒载体.方法:对比HDAC2基因序列,设计并合成短发夹RNA(shRNA)干扰靶点序列,克隆入经AgeI与EcoRI双酶切后的RNA干扰载体pLKO.1-puro,构建pLKO.1-HDAC2-shRNA重组质粒,采用酶切法和测序法验证重组质粒.结果:成功退火合成3对短发夹RNA序列并将其克隆入pLKO.1-puro载体中,构建重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、pLKO.1-HDAC2-shRNA2及pLKO.1-HDAC2-shRNA3,经酶切鉴定和测序验证重组质粒载体与预期靶序列相同.结论:成功构建HDAC2-shRNA慢病毒干扰载体,为进一步研究HDAC2的功能及应用提供有效工具.     

大鼠蛋白激酶Cγ基因小发卡RNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的鉴定

目的：研究指出蛋白激酶Cγ（PKCγ）在脊髓水平上参与了伤害性信号的传递,文中拟构建大鼠PKCγ基因的小发卡RNA（shRNA）慢病毒载体,并在细胞水平鉴定其干扰效率。方法：根据PKCγ-mRNA序列,选择3条19nt的靶序列,设计并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入到pLVTHM载体的H1启动子后获得重组质粒,同时构建一个非特异性对照质粒。将所构建的质粒与pMDLg-pRRE、pR sv-REV、pMD2G共转染293T细胞,包装产生慢病毒后,分别感染C6细胞,经免疫印迹技术（W estern b lot）检测PKCγ基因的蛋白表达水平以评价慢病毒载体的抑制效率。结果：测序证实成功构建了3个大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,分别感染C6细胞后pLV-PKC2和pLV-PKC3可明显降低PKCγ蛋白的表达,其中以pLV-PKC2（靶向位点：＋1913＋1931）的慢病毒抑制效率最高。结论：成功构建了大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,且慢病毒载体pLV-PKC2能特异、高效地抑制PKCγ基因的表达。     

人乳头状瘤病毒16型E6基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的以人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型E6基因为靶点,构建小发夹状RNA（small hairpin RNA,shRNA）慢病毒载体.方法将HPV 16E6基因的特异性序列,应用基因重组技术插入到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中.重组质粒命名为pGCL-GFP-HPV16-E,测序鉴定后与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染293T细胞,病毒液根据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平测定滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实HPV16 E6 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液,测定滴度为2×109 TU/mL.结论应用基因重组技术等方法,可成功构建HPV16 E6 shRNA慢病毒载体.     

人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体的构建及测序

目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定.方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经Spe Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切线性化的pHSER-dsRNA-GFP-SIN质粒上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定.结果将合成的两对人CCL20基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后,分别克隆到线性化的pHSER-dsRNA-GFP-SIN载体质粒上.在氨苄青霉素培养基条件下,筛选出相应的阳性菌落,经DNA测序鉴定确实为所需序列.结论构建成功了2对人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,可进一步用于干扰CCL20基因的mRNA转录,从而为制备CCL20基因表达抑制型的人角朊干细胞奠定基础.     

小鼠动力蛋白激活蛋白1-shRNA慢病毒载体的构建及在足细胞中的敲低效应

目的 构建表达小鼠动力蛋白激活蛋白1 (dynactin-1)特异性shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠足细胞dynactin-1的敲低效果.方法 针对小鼠dynactin-1 mRNA序列,设计合成3种shRNA,克隆到入门质粒pENTR/pTER中,再利用LR反应重组到pLenti X2 Puro慢病毒目的质粒,经过酶切测序鉴定后,将慢病毒质粒和包装质粒共转染293FT细胞,包装得到病毒颗粒.各组shRNA病毒载体转染小鼠足细胞后,用嘌呤霉素抗性筛选细胞,利用蛋白质印迹法检测各组细胞中dynactin-1蛋白的表达水平.结果 构建的各组shRNA入门质粒和慢病毒载体经酶切及测序鉴定正确;慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,制备病毒颗粒,转染小鼠足细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达shRNA的足细胞系;蛋白质印迹检测结果表明转染dynactin-1-shRNA组的dynactin-1蛋白表达降低.结论 构建的小鼠dynactin-1-shRNA慢病毒载体能有效降低小鼠足细胞中dynactin-1蛋白表达,为进一步研究dynactin-1在足细胞中的功能奠定了基础.     

大鼠TGF-β1基因shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)基因短发卡RNA干扰慢病毒载体,并通过感染大鼠原代逼尿肌细胞进行鉴定。方法:根据大鼠TGF-β1基因设计合成3对shRNA序列,将其分别连接至带荧光标签和抗性基因的慢病毒载体pHBLV上,通过转化至DH5α感受态细胞,提取阳性克隆后用DNA测序进行鉴定,选择序列正确的克隆大量扩增并提取重组的慢病毒质粒。将重组慢病毒质粒和慢病毒包装的辅助质粒转染至293T细胞进行慢病毒包被,抗性筛选后通过荧光法对病毒进行滴度测定。用慢病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:设计的3种大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体经测序鉴定构建成功。使用该病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,qRT-PCR和Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,3种TGF-β1 shRNA感染组的细胞TGF-β1在mRNA和蛋白水平均有不同程度的下调,其中TGF-β1 shRNA 2的蛋白敲低效率最好(57%)。结论:本研究成功构建了大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体,并在大鼠原代逼尿肌细胞中进行了鉴定,为进一步的基因治疗研究提供了可能性的基础。     

大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术进一步研究MeCP2功能.方法 设计针对大鼠MeCP2 mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用菌落PCR法、酶切及DNA测序鉴定重组克隆.结果 重组克隆经菌落PCR及酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确.结论 两个大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用RNAi研究大鼠MeCP2功能打下了基础.     

慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

 目的  构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法  使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果  PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论  成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

人前脑啡肽原基因真核表达载体的构建

目的 构建人前脑啡肽原基因真核表达载体，为进一步研究内源性脑啡肽的镇痛活性及相关药物研发奠定基础。方法 取新鲜的人脑颞叶皮质组织，用提取RNA的试剂盒提取总RNA，逆转录成cDNA。设计两对引物，用巢式PCR的方法获得人脑啡肽原基因，并将其插入到克隆载体pMD18-T中，克隆扩增。双酶切真核表达质粒pCDNA3．1（＋）及T载体中的目的片段，胶回收重组构建成pCDNA3．1（＋）-PENK表达载体。最后限制性酶切鉴定该表达载体。结果 采用巢式RT—PCR技术可以获得人前脑啡肽原基因，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列。凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pCDNA3.1（＋）内。结论 成功构建了pCDNA3．1（＋）-PENK真核表达质粒。可作为疼痛基因治疗实验研究的有力工具。     

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的：设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR( RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109 TU/ml,pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

沉默组织因子重组腺病毒的构建和胰岛中沉默效果检测

目的 构建复制缺陷型重组腺病毒介导短发夹RNA(shRNA):干扰组织因子(TF)在胰岛表达.方法 设计并合成四对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导入成人胰岛,通过实时定量RT-PCR方法筛选对TF沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组.筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达TF-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒并测定其病毒滴度.通过实时定量RT-PCR腺病毒沉默TF效果予以检测.结果 测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从四对ds oligos筛选出对组织因子沉默效果最佳的穿梭质粒pENIR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-TF复制缺陷型重组腺病毒.转染胰岛后,通过实时定量RT-PCR方法检测发现shRNA-TF腺病毒感染胰岛后对TF mRNA的沉默效果4 d后达最佳效果,为54.29%(P＜0.05 vs NC).结论 成功构建的介导shRNA复制缺陷型重组腺病毒可以体外抑制胰岛细胞中组织因子的表达.     

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的 设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法 应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体p GLV3-GFP中,构建p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果 测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109TU/ml,p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论 成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向Survivin基因及CDKl基因的短发夹样RNA（Short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体。方法根据Genbank报道的Survivin序列及CDKl序列,遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDKl基因的shRNA寡核苷酸序列,构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒,并进行限制性内切酶酶切及基因测序鉴定。结果经酶切及测序结果分析,pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shR-NA-Survivin-U6-shRNA—CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建。结论成功构建Survivin基因及CDKl基因联合靶向shRNA重组质粒,为进一步研究Survivin基因和CDKl基因联合干扰提供了新的方法。     

Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

人eIF4E基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的设计并构建人真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因shRNA慢病毒质粒表达载体。方法设计合成人eIF4E基因RNA干扰双链DNA片段,重组到慢病毒质粒PLVTHM上,然后进行PCR鉴定和测序分析。重组质粒与3种包装质粒混合,以LipoD293TMDNA In Vitro包裹后转染293T细胞,收获病毒上清液感染宫颈癌HeLa细胞。结果经过PCR鉴定出的重组载体测序结果与目的序列一致,成功构建人eIF4E基因shRNA慢病毒质粒表达载体及获得相应慢病毒,并成功感染HeLa细胞,可见绿色荧光蛋白表达。结论成功构建人eIF4E基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。