HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建人HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体.方法 利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-miR表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.结果 经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α miR.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒RNA干扰载体.     

靶向 EphB4的慢病毒干扰载体对结肠癌细胞中 EphB4及 EphrinB2表达的影响

目的：有研究显示EphB4在肿瘤发生发展中的作用与其配体EphrinB2密切相关。文中主要通过慢病毒介导的RNA干扰技术干扰结肠癌细胞中EphB4基因的表达,观察EphB4基因表达改变对其配体EphrinB2表达的影响。方法根据EphB4基因序列设计并合成3对miRNA的oligo DNA,退火形成双链后与pcDNA6．2-GW/EmGFP-miRNA载体相连并瞬时转染HEK293细胞,通过荧光显微镜、qPCR筛选出干扰效率最高的质粒,将其与中间载体pDONR221和慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-EphB4。用脂质体将慢病毒载体以及包装质粒（ pLP1、pLP2和pLP/VSVG）共转染293 FT细胞,收集上清Lenti-miR-EphB4感染HEK293细胞株进行滴度鉴定。将获得的病毒液感染人结肠癌细胞株,通过荧光显微镜和qPCR检测结肠癌细胞中EphB4及其配体EphrinB2的表达变化。结果测序结果表明3对干扰载体SR1、SR2、SR3序列与参考序列一致,成功转染HEK293细胞后,各转染组细胞荧光显微镜下均可见到绿色荧光蛋白表达;qPCR显示载体 SR-3的沉默效率最高;构建出来的慢病毒载体pLenti6．3/V5-DEST-miR-EphB4在293FT细胞中包装成功,所得慢病毒滴度为7×108 TU/mL;Lenti-miR-EphB4浸染后,SW480和Caco-2中EphB4 mRNA相对表达量（0．49±0．02、0．62±0．04）均较原始SW480（1．00±0．00）和Caco-2降低（1．00±0．00）,差异有统计学意义（P＝0．000）;SW480中EphrinB2 mRNA表达量F （2．11±0．04）较原始SW480（1．00±0．00）明显升高（P＝0．000）;而Caco-2细胞中EphrinB2 mRNA表达无明显改变（1．01±0．02）,差异无统计学意义（P＝0．315）。结论靶向EphB4的慢病毒干扰载体能够有效降低SW480及 Caco-2细胞中EphB4 mRNA表达水平。 EphB4与其配体EphrinB2之间的相互作用可能受到多种因素调控,有待后续深入研究。     

针对人NeuroD基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人神经源性分化蛋白基因(NeuroD)RNA干扰慢病毒表达载体。方法 根据已公布的NeuroD基因序列(GenBank:NM_002500),设计并合成4 对shRNA(NeuroD1~D4),与载体pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD 表达载体,转化入感受态细胞DH5α; real-time PCR 技术检测pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果。将筛选出的干扰载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1与慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST经酶切后连接,构建慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(Packaging Mix)共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。采用PCR法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果 成功构建针对靶基因的4个干扰质粒,测序结果表明,4个pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体序列与参考序列一致,real-time PCR 检测显示以pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1的沉默效应最佳(P<0.01)。将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR转染至293T细胞株,酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期一致,病毒滴度达1.18×108 ifu/mL。结论 成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

慢病毒携带shRNA对内皮细胞组织因子表达的抑制作用

目的:构建RNA干扰慢病毒栽体,研究慢病毒携带的短发夹干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)对内皮细胞中组织因子(tissue factor,TF)表达的抑制作用.方法:将靶向人TF基因的2条shRNA表达序列克隆到慢病毒栽体pENTRTM/U6的黏性末端,测序鉴定后,与目标栽体pLenti6/BLOCKiTTM-DEST vector进行位点特异性重组,再测序;经脂质体导入293 FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并测定病毒滴度.RT-PCR和ELISA检测干扰后内皮细胞TF的表达.结果:将目的序列成功连接到裁体上,并经测序分析证实载体构建成功;在293FT细胞中进行慢病毒包装,收集上清并检测病毒滴度为5×105/TU.RT-PCR和ELISA检测结果证实构建的携带shRNA的慢病毒可显著抑制内皮细胞TF的表达.结论:成功构建了携带人TF基因的RNAi慢病毒载体,慢病毒携带的短发夹干扰RNA能干扰内皮细胞中TF的表达,可为血栓栓塞性疾病的防治提供一种有效的方法.     

miR-610的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的:克隆微小RNA hsa-miR-610并构建其慢病毒表达载体.方法:将PCR扩增得到的miR-610前体序列和pcDNA6.2-GW/EmGFP载体经双酶切后连接产生pcDNA6.2-miR-610真核表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.通过BP反应及LR反应将pre-miR-610克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST,构建miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610.结果:将构建好的慢病毒表达载体导入大肠杆菌Stb13进行扩增,测序表明所构建的载体与预期的完全一致.结论:成功构建了miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610,为深入研究miR-610的生物学功能奠定了基础.     

永生化人肝星状细胞株WM07的建立

目的 以慢病毒载体介导猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）大肿瘤抗原（large tumor antigen，TAg）转染原代人肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）获得永生化HSC株。方法 以含SV40 TAg cDNA序列的SV40 tsA58质粒为模板，PCR获取全长SV40 TAg序列，经TOPO克隆进入pENTR^TMTOPO^®；载体，PCR鉴定获得pENTR-SV40 TAg Entrez质粒，再经LR重组反应将SV40 TAg cDNA克隆到目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST，PCR鉴定pLenti4/V5-GW/SV40 TAg质粒，进一步用该质粒转染工程细胞293FT进行假病毒包装，用含包装病毒的细胞培养上清液转染原代人HSC，经博来霉素筛选获得稳定表达SV40 TAg的人HSC株（命名为WM07），并对细胞进行SV40 TAg及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达的检测和鉴定。结果 对pENTR-SV40 TAg Entrez质粒及pLenti4/V5-GW/SV40 TAg慢病毒表达质粒进行PCR测序，结果证实所构建的质粒含ATG转录起始位点及SV40 TAg cDNA序列。对经过转染、筛选获得的WM07行免疫荧光染色，结果显示SV40 TAg在细胞核表达和定位，细胞质内均表达活化的HSC标志物α-SMA。结论 pLenti4/V5-GW/SV40 TAg质粒构建成功。经质粒转染，获得永生化HSC株WM07，可稳定传代并用于肝纤维化研究。     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.     

人CCR5Delta32基因重组慢病毒载体的构建及表达

目的:构建含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并鉴定其表达性能。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序。再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析。最后用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32四种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并通过Western blot鉴定目的基因在靶细胞内的表达。结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与发表于GenBank上的序列完全一致。经酶切鉴定,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中。四种质粒共转染293T细胞,产生出5×105TU/ml高滴度的重组慢病毒。用其感染靶细胞,Western blot结果显示有目的蛋白表达。结论:成功构建了含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并将其在293T细胞内表达,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础。     

RANTES-K慢病毒载体的构建及其慢病毒的产生和鉴定

目的：构建含CC细胞内趋化因子（CC-intrakine,RANTES-K）基因的慢病毒载体,为研究Ⅰ型人免疫缺陷病毒（HIV-1）感染的基因治疗奠定基础．方法：应用PCR技术,扩增目的基因片段RANTES-K,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6／V5-D-TOPO载体,构建慢病毒载体pLenti6／V5-R-K,并在293FT细胞中建立慢病毒株,最后转染HeLa细胞观察RANTES蛋白的表达．结果：成功构建了慢病毒载体pLenti6／V5-R-K,并证实RANTES蛋白可在人宫颈癌HeLa细胞系内表达．结论：慢病毒载体可介导CC-intrakine（RANTES-K）基因高效稳定转染HeLa细胞,可用于抗HIV-1感染的基因治疗．     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

前列腺癌免疫治疗中质粒pLenti6／V5-D-TOPO-TβRⅡDNglytk构建的意义及相应慢病毒的产生

目的构建含有TβRⅡDNglytk的慢病毒质粒载体,生产出相应的慢病毒,用于对TGF—β失敏感的CTL的制备。方法先以原始质粒为模板,PCR扩增TβRⅡDN和HSV—tk基因,用重组PCR方法获得TβRⅡDNglytk融合基因,用PCR扩增出TRANSglytk基因;再用TOPO克隆技术将其连接到慢病毒表达质粒,经测序验证;最后用Invitrogen公司提供的ViraPowerTMLentiviralSystem和293细胞合成慢病毒,并用293细胞完成其滴度测定。结果完成慢病毒质粒TβRⅡDNglytk的构建,经测序验证序列正确;生产的慢病毒具有感染能力,其滴度达到实验要求,叮用于对TGF—B不敏感的肿瘤特异性CTL的制备。结论运用重组PCR技术合成TβRⅡDNglytk及TRANSglytk两个融合基因,并用TOPO克隆技术连接到pLenti6／V5-D-TOPO载体,成功构建了慢病毒表达载体,说明此方法用于病毒载体的构建是快捷可行的;用ViraPowerTMLentiviralSystem和293FT细胞成功制备了慢病毒,为生产TGF—B不敏感的人肿瘤特异性CTL提供了基础。     

前列腺癌免疫治疗中质粒pLenti6/V5-D-TOPO(R)-TβRⅡDNglytk构建的意义及相应慢病毒的产生

目的 构建含有TβRⅡDNglytk的慢病毒质粒载体,生产出相应的慢病毒,用于对TGF-β失敏感的CTL的制备.方法 先以原始质粒为模板,PCR扩增TβRⅡDN和HSV-tk基因,用重组PCR方法获得TβRⅡDNglytk融合基因,用PCR扩增出TRANSglytk基因;再用TOPO克隆技术将其连接到慢病毒表达质粒,经测序验证;最后用Invitrogen公司提供的ViraPowerTM Lentiviral System和293FT细胞合成慢病毒,并用293细胞完成其滴度测定.结果 完成慢病毒质粒TβRⅡDNglytk的构建,经测序验证序列正确;生产的慢病毒具有感染能力,其滴度达到实验要求,可用于对TGF-β不敏感的肿瘤特异性CTL的制备.结论 运用重组PCR技术合成TβRⅡDNglytk及TRANSglytk两个融合基因,并用TOPO克隆技术连接到pLenti6/V5-D-TOPO(R)载体,成功构建了慢病毒表达载体,说明此方法用于病毒载体的构建是快捷可行的;用ViraPowerTM Lentiviral System和293FT细胞成功制备了慢病毒,为生产TGF-β不敏感的人肿瘤特异性CTL提供了基础.     

人FAM172A基因慢病毒载体的构建及其在巨噬细胞中的表达

目的 构建人FAM172A基因慢病毒载体,并包装慢病毒FAM172A感染人巨噬细胞予以鉴定.方法 以PDC315-FAM172A为模板扩增FAM172A基因全长序列后,与慢病毒载体pLenti6.3/V5-GFP经酶切、连接转化大肠杆菌,挑取阳性克隆,行菌液PCR、酶切及测序鉴定.将鉴定正确的FAM172A基因慢病毒载体和病毒包装质粒共转染FT293细胞包装慢病毒FAM172A,测定病毒效价.Western blot和QPCR验证慢病毒FAM172A感染巨噬细胞效果.结果 菌液PCR、酶切及测序结果显示FAM172A基因成功插入到慢病毒载体中.病毒包装后荧光显微镜观察到FT293细胞中有大量绿色荧光,病毒效价为1.2×108TU/ml.Western blot和QPCR结果显示,慢病毒FAM172A侵染靶细胞后可明显增加目的基因FAM172A的表达.结论 成功构建慢病毒FAM172A,为后续FAM172A基因功能研究奠定了基础.