p38MAPK基因RNAi慢病毒载体的构建及在MC3T3-E1细胞的表达

目的 构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响.方法 设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,流式细胞仪检测病毒滴度,p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞,荧光定量PCR 检测MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达,进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选.22.2 mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7 d,Western blot检测MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白的表达,流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡.结果 酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108 TU/ml. p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上,RT-PCR检测结果显示,各p38MAPK-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%(P<0.01),其中以p38MAPK-shRNA2的干扰效率最高.Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组、空载体转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达明显增加(P<0.01).p38MAPK-shRNA慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组明显下调(P<0.01).流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加(P<0.01);p38MAPK-shRNA慢病毒转染组以及p38MAPK信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少(P<0.05,P<0.01).结论 成功构建了靶向p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38MAPK基因表达,减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡.     

小鼠11β-HSD1基因过表达的前成骨细胞系的建立

目的:探索小鼠11β-HSD1基因过表达的前成骨细胞系的建立方法?方法:构建过表达小鼠11β-HSD1基因的慢病毒载体,包装?收集?纯化慢病毒,感染小鼠MC3T3-E1前成骨细胞系,用BSD(一种核苷抗生素)筛选出感染成功的细胞,荧光定量PCR及Western blot检测11β-HSD1过表达情况,诱导成骨分化后用茜素红染色法染色矿化结节?结果:成功构建了小鼠11β-HSD1基因过表达慢病毒载体,高效感染MC3T3-E1细胞系?荧光定量PCR及Western blot结果显示,11β-HSD1过表达病毒组细胞11β-HSD1 mRNA水平是空载病毒对照组的17.4倍,蛋白表达量比空载病毒对照组增加?茜素红染色结果表明慢病毒感染的细胞成骨分化良好,细胞正常成骨分化功能未受影响,11β-HSD1过表达细胞成骨分化减少?结论:本研究成功建立了过表达小鼠11β-HSD1的前成骨细胞系,为研究11β-HSD1对成骨细胞的具体作用提供了研究基础?     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

多西环素通过MEK/ERK信号通路促进MC3T3-E1细胞株体外成骨分化

目的：研究在体外条件下多西环素（doxycycline,DOX）对前成骨细胞株MC3T3-E1成骨分化的影响及可能机制。方法：在成骨诱导剂体外诱导MC3T3-E1细胞株成骨分化条件下，茜素红染色检测成骨细胞分化；实时定量PCR检测DOX对MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的影响；用DOX、MEK抑制剂（U0126）单独或联合处理MC3T3-E1细胞后，Western blot检测N-cadherin、p-MEK及p-ERK等蛋白的表达。结果：在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中，加入DOX可以增强茜素红染色阳性率。DOX上调MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的表达。DOX处理MC3T3-E1细胞后，其N-cadherin蛋白表达水平下降（P <0.05）,p-MEK和p-ERK蛋白的表达增加（P <0.05）。而MEK拮抗剂（U0126）则显著上调N-cadherin蛋白表达水平，同时降低p-MEK、p-ERK水平。用U0126联合DOX处理MC3T3-E1细胞后，DOX对N-cadherin、p-MEK和p-ERK蛋白水平的影响可被U...     

miR-129-5p调控MC3T3-E1细胞成骨分化的体外研究

背景 微小RNA(microRNA,miR)是一种非编码的小分子化合物,在成骨分化等生命过程中发挥重要调控作用.目的 探讨miR-129-5p对小鼠成骨前体细胞(preosteoblast cell line,MC3T3-E1)成骨分化功能的影响及相关作用机制.方法 体外培养MC3T3-E1细胞后,分别转染慢病毒载体(miR-control、miR-129-5p mimic和miR-129-5p inhibitor),以过表达或敲低细胞miR-129-5p水平.成骨诱导分化培养细胞后,使用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色试剂盒检测碱性磷酸酶的活性,茜素红(alizarin red staining,ARS)染色观察钙结节形成情况,以检测细胞成骨分化水平.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法和Western blot法检测成骨分化基因Runx2和OCN的mRNA及蛋白表达水平.生物信息学方法预测miR-129-5p靶基因,并用双荧光素酶基因报告实验验证.结果 转染慢病毒载体的MC3T3-E1细胞进行成骨诱导分化后,与miR-control组相比,转染miR-129-5p mimic的MC3T3-E1细胞7 d后碱性磷酸酶染色增强,成骨早期标志物Runx2表达增加,14 d后成骨晚期标志物OCN表达升高,21 d后茜素红染色显示钙化结节较大且量多(P<0.05).而转染miR-129-5p inhibitor慢病毒的MC3T3-E1细胞与miR-control组相比,碱性磷酸酶活性低,钙结节较小且少,成骨标志物Runx2和OCN表达下降(P<0.05).通过Targetscan网站(生物信息分析)预测miR-129-5p的靶基因为BMP通路负向调控蛋白Smad6;双荧光素酶报告实验验证Smad6为靶基因,过表达miR-129-5p后Smad6蛋白表达水平下调.结论 miR-129-5p通过靶向抑制Smad6的表达对MC3T3-E1细胞成骨分化产生促进作用.     

聚乙烯亚胺介导miR-2861模拟物转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化

目的：通过非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI）介导miRNA-2861（miR-2861）模拟物转染MC3T3-E1细胞系,探讨miR-2861/PEI复合物在前成骨细胞中的转染效率及其对细胞增殖和成骨向分化的影响。方法：将适量的PEI分别与miR-2861和阴性对照（NC）以元素N/P=10的比例混合形成基因/载体复合物。将miR-2861/PEI复合物作为实验组,NC/PEI复合物作为阴性对照组以排除人工合成的双链基因对成骨作用的干扰。采用MTT法筛选PEI复合miR-2861模拟物的最佳使用浓度;应用荧光成像和茎环法RT-PCR技术分别检测10、30、50和100 nmol·L^-1 miR/PEI复合物对MC3T3细胞的瞬时转染效率和miR-2861的表达情况;采用qRT-PCR技术和茜素红染色检测用选定浓度瞬时转染miR-2861/PEI复合物作用下MC3T3细胞的成骨能力。结果：与空白对照组比较,100 nmol·L^-1 miR-2861/PEI复合物作用72h时MC3T3细胞增殖率明显下降（P<0.05）。随转染浓度增加,miR-2861/PEI复合物在MC3T3细胞中的转染效率逐渐升高。茜素红染色及定量分析,实验组诱导21 d后出现较多的钙盐沉积结节,而空白对照组和阴性对照组均较少。结论：以PEI作为载体可使miR-2861模拟物有效转染MC3T3-E1细胞并在细胞中高表达,miR-2861模拟物具有一定的促MC3T3-E1细胞成骨向分化的作用。     

MC3T3-E1细胞成骨模型的建立及局部黏着斑激酶表达的研究

目的:通过化学诱导手段建立MC3T3-E1细胞成骨模型，探讨局部黏着斑激酶(FAK)基因表达与成骨细胞形成的关系，了解FAK对成骨分化的影响。方法:观察MC3T3-E1细胞成骨诱导前后细胞形态，茜素红化学染色检测矿化情况，实时荧光定量PCR检测成骨标志物Runx2、ALP的表达，同时分析FAK在成骨过程中的表达情况。结果:MC3T3-E1细胞成骨诱导3 d后细胞呈长梭形或多角形；第21、28 d时，茜素红染色可见矿化结节；成骨标志物Runx2、ALP的表达呈持续升高的趋势，FAK的表达总体呈升高趋势，在第7 d时略有下降。结论:FAK的表达与成骨相关基因的表达趋势基本一致，提示FAK可能在MC3T3-E1细胞成骨过程中发挥一定作用。     

miR-TH克隆及慢病毒载体的构建

目的：克隆microRNA-酪氨酸羟化酶（TH）,构建慢病毒载体。方法：根据TH基因序列（NM_009377.1）,设计并合成4对微小RNA（miRNA）的Oligo DNA,退火形成双链后与pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miRNA载体相连,用Gateway技术将构建好的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-TH载体先后与中间载体pDONRTM221、慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接,构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-TH,用脂质体2000（lipofectamine 2000）将慢病毒载体以及包装质粒（pLP1,pLP2和pLP/VSVG）共转染HEK-293FT细胞,收集上清,感染293T细胞株进行滴度鉴定。结果：测序结果表明,4对pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-TH表达载体序列与参考序列一致,构建出来的慢病毒载体在293FT细胞中包装成功,并通过293T细胞测得慢病毒滴度为5×106 TU/ml。结论：成功构建了TH的慢病毒干扰载体pLenti6/V5-DEST-TH,为利用RNA干扰技术进一步研究TH基因的功能和作用奠定了基础。     

小鼠动力蛋白激活蛋白1-shRNA慢病毒载体的构建及在足细胞中的敲低效应

目的 构建表达小鼠动力蛋白激活蛋白1 (dynactin-1)特异性shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠足细胞dynactin-1的敲低效果.方法 针对小鼠dynactin-1 mRNA序列,设计合成3种shRNA,克隆到入门质粒pENTR/pTER中,再利用LR反应重组到pLenti X2 Puro慢病毒目的质粒,经过酶切测序鉴定后,将慢病毒质粒和包装质粒共转染293FT细胞,包装得到病毒颗粒.各组shRNA病毒载体转染小鼠足细胞后,用嘌呤霉素抗性筛选细胞,利用蛋白质印迹法检测各组细胞中dynactin-1蛋白的表达水平.结果 构建的各组shRNA入门质粒和慢病毒载体经酶切及测序鉴定正确;慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,制备病毒颗粒,转染小鼠足细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达shRNA的足细胞系;蛋白质印迹检测结果表明转染dynactin-1-shRNA组的dynactin-1蛋白表达降低.结论 构建的小鼠dynactin-1-shRNA慢病毒载体能有效降低小鼠足细胞中dynactin-1蛋白表达,为进一步研究dynactin-1在足细胞中的功能奠定了基础.     

HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定

[目的]构建带有大鼠HIF-1α基因的慢病毒表达载体,并进行病毒颗粒的包装与对293T的转染.[方法]从pEGFP-N1-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将目的基因与pLenti6.3-MCS-RES2-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,并用磷酸钙转染法将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,48h后收集上清液并过滤,按不同感染复数感染293T细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度和感染效率.[结果]构建了共表达HIF-1α基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,经PCR及测序结果证实,并对其成功包装出慢病毒,病毒滴度为4×106TU/ml.[结论]成功构建出HIF-1α基因重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP并能有效的包装出慢病毒.     

大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。     

人Prohibitin 2哺乳动物细胞株的转染表达与定位的初步研究

目的 构建带FLAG标签的人类野生phb2 (prohibitin 2)表达载体,将其转染至HEK 293T细胞检测其表达,转染至COS7细胞观察phb2蛋白在细胞内的定位.方法 以含有人phb2全长cDNA序列的质粒为模板,通过带有FLAG标签上游引物,用PCR方法扩增phb2全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3中构建pCDNA3-FLAG-phb2表达载体,将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.结果 成功构建了pCDNA3-FLAG-phb2表达载体,转染表明此表达载体在HEK 293T细胞中能够有效表达,在COS7细胞中phb2呈斑点状主要在胞质内分布,细胞核中未见到明显的表达.结论 实验结果为进一步了解phb2的功能提供了一定的基础.     

miR-610的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的:克隆微小RNA hsa-miR-610并构建其慢病毒表达载体.方法:将PCR扩增得到的miR-610前体序列和pcDNA6.2-GW/EmGFP载体经双酶切后连接产生pcDNA6.2-miR-610真核表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.通过BP反应及LR反应将pre-miR-610克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST,构建miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610.结果:将构建好的慢病毒表达载体导入大肠杆菌Stb13进行扩增,测序表明所构建的载体与预期的完全一致.结论:成功构建了miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610,为深入研究miR-610的生物学功能奠定了基础.     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测

目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1( NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础.方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列.把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率.结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内.通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上.表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70％以上.结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具.     

人鼠共打靶 ERβ特异性基因沉默载体的构建和鉴定

目的：：构建人和鼠共打靶特异性 ERβ基因沉默慢病毒载体。方法：检索人和小鼠 ERβ基因转录本及其序列,应用 SiRNA Target Finder 软件设计人和小鼠共打靶 ERβ基因沉默 siRNA 和阴性对照siRNA,合成发夹状双链 shRNA,与线性化质粒 PLL3.7连接构建为重组质粒(ERβ-shRNA-PLL3.7和阴性对照质粒 ER-N-shRNA-PLL3.7),经鉴定后,转染人成骨肉瘤细胞 MG63和小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,经 Realtime-PCR 和 western blot 法检测重组质粒对目的基因沉默效果。应用 SPSS16.0软件统计分析,检验水准为α=0.05。结果：经测序证明重组质粒中含有目的 shRNA 序列。分别转染小鼠成骨细胞株 MC3T3-E1和人成骨肉瘤细胞 MG63细胞后,无论 Realtime-PCR 检测 ERβ基因表达,还是western blot 法检测蛋白表达,均较空白对照组或阴性对照组显著降低,差异有显著性,P <0.05。结论：成功构建了人和小鼠共同高效打靶的 ERβ基因沉默慢病毒载体质粒,并包装成假病毒颗粒,为利用小鼠作为动物模型研究人基因功能或开发基因药物奠定了基础。     

木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3 T3-E1增殖、分化、矿化和Wnt通路的影响

目的:探讨木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化及Wnt通路的影响.方法:在体外培养的MC3T3-E1s培养基中加入木犀草素0.25~8.00μmol/L培养12、24和48 h,以洛伐他汀0.04μmol/L作为阳性对照,采用细胞计数试剂盒法检测细胞增殖情况;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞内ALP的活性;茜素红S染色法检测细胞矿化能力;采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞Ⅰ型胶原、骨钙素、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)、β-连环素、护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达水平.结果:木犀草素可以剂量依赖性和时间依赖性地促进成骨细胞MC3T3-E1增殖(P<0.05~P<0.01);木犀草素(2.00、4.00和8.00μmol/L)可以剂量依赖性地促进MC3T3-E1成骨细胞ALP活性,增强MC3T3-E1成骨细胞矿化能力并上调MC3T3-E1成骨细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素、Lrp5、β-连环素和护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达.结论:木犀草素2.00、4.00和8.00μmol/L可以促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化及Wnt通路中Lrp5和β-连环素mRNA的表达.