人神经干细胞临床移植治疗帕金森病

目的:探索人神经干细胞移植治疗帕金森病(Parkinson disease,PD)的有效方法.方法:5～11周人胚胎的前脑细胞在体外稳定扩增,并向多巴胺神经元转化,通过立体定向手术将其植入PD患者的纹状体;2000年11月至2002年11月,采用此方法治疗50例PD患者.结果:人胚胎前脑细胞可在体外扩增并维持不分化状态1年以上,扩增的细胞可达原始细胞数量的1×107倍,并可向多巴胺能神经元转化;PD患者临床移植手术后随访8～30个月(平均24个月),有效率为92％,未见明显的免疫排斥反应.结论:应用体外长期扩增的人类神经干细胞移植治疗PD是可行和有效的.     

人乳头瘤病毒DNA载量与尖锐湿疣复发的相关性

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)DNA载量与尖锐湿疣(CA)复发的关系.方法采用实时荧光定量PCR技术,对31例初发性和32例复发性CA患者的疣体组织进行HPV6/11和HPV16/18 DNA的定量检测.结果 63例CA中,62例HPV6/11DNA阳性,阳性率98.4%.初发性CA HPV 6/11DNA载量为1.4×103～6.7×107copies/ml,平均(8.4×106±1.7×107)copies/nl;复发性CA HPV 6/11DNA载量为1.2×104～3.6×108copies/ml,平均(2.9×107±6.7×107)copies/ml.在62例HPV6/11阳性中,有7例HPV16/18 DNA同时阳性,占11.3%,其中初发性CA 2例,复发性CA 5例,初发性CA HPV 16/18 DNA载量为1.9×103～1.6×104copies/ml,平均(8.7×103±9.6×103)copies/ml,复发性CA HPV 16/18 DNA载量为1.4×105～1.7×107copies/ml,平均(5.7×106±7.1×106)copies/ml.复发性CA的HPV6/11和HPV16/18 DNA载量高于初发性CA,差异均具有显著性(P＜0.05).HPV6/11 DNA的载量随着复发次数以及病程的增加而升高,呈正相关,相关系数r分别为0.37和0.30.结论 HPV DNA病毒载量与CA复发之间存在着一定的相关性.     

3～18周胎龄人胚胎神经干细胞的分离、培养及增殖

目的:在分离、纯化、培养3～18周胎龄人胚胎神经干细胞(NSC)的基础上,进一步研究3～18周胎龄NSC的增殖特点.方法:从3～18周龄流产人胚胎的大脑皮质和神经管组织中分离NSC,实验分组:A组(3～6周龄),B组(7～11周龄),C组(12～18周);培养、纯化NSC;以单细胞克隆实验及免疫细胞化学对其进行生物学特性鉴定;计数神经球数目、直径检测其生长情况.结果:从3～6周流产人胚胎大脑皮层和神经管组织中以及7～18周的人胚胎大脑皮层中均分离获得了可在体外生存增殖的NSC,经鉴定,该类细胞在生长方式、形态结构、功能特征、表面标志等方面,均具有典型NSC的生物学特征;A组人胚胎NSC的神经球数目和直径均大于B、C组(P＜0.05).结论:3～18周胎龄组NSC的增殖能力均随胎龄的增加而逐步减弱.     

骨髓和脐血间质干细胞联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症269例疗效研究

目的 观察骨髓间质干细胞(BMSCs)和脐血间质干细胞(CMSCs)联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症(DMD)的临床疗效.方法 2007年6月-2009年3月对269例DMD患者行自体BMSCs和CMSCs联合移植方案进行治疗,患者均使用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF),5～10 μg/kg,2次/d,皮下注射动员骨髓干细胞4 d,于第5天行骨髓采集术,局部麻醉下从髂后上棘抽取骨髓100～180 ml.将采集的骨髓液经Ficoll密度梯度离心后,分离单个核细胞2.0×109,用Uitra cul Ture 培养液调节细胞数量为1×105/ml～1×106/ml,接种于75 mm2培养瓶中,24 h换液,7～10 d后收集全部细胞,总数为4.0×108/ml～1.5×109/ml.将BMSCs移植到患者四肢近端肌肉内.采集脐血80～160 ml,Ficoll密度梯度离心,分离单个核细胞并诱导分化为CMSCs.将CMSC(1.0～4.8)×107细胞悬液,经静脉缓慢输注,每5～7 d 1次,共3次.移植后6个月对患者的肌力、步行10 m和推轮椅10 m所需时间、肌酸激酶水平、肌电图等进行观察.结果 269例患者移植后6个月时随访,218例患者(81.0%)肌力有不同程度的增加.干细胞移植后235例患者复查心肌酶谱,其中188例(80%)患者步行10 m及推轮椅10 m所需时间明显缩短,与移植前比较差异有统计学意义(P<0.05),干细胞移植后患者肌酸激酶水平较移植前明显下降(P<0.01).51例患者复查肌电图,32例(62.7%)患者波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少.47例患者复查大腿肌肉磁共振成像,肌肉影像较移植前变化不明显.结论 BMSCs和CMSCs移植治疗DMD,对肌肉组织有一定的修复作用,使DMD患者的运动功能得到改善,肌力有所提高,肌酸激酶较移植前下降.移植后复查肌电图波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少.MSCs移植无不良反应,患者依从性好,是治疗DMD的新手段.     

经动脉自体骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死

目的 观察经动脉自体骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死的临床效果.方法 30例股骨头缺血性坏死患者在无菌条件下,从髂后上棘抽取骨髓150～200 ml,在体外分离纯化骨髓源性干细胞并制成10 m1细胞悬液,其单个核细胞计数为3.6×108～1.8×1011 ml,采用流式细胞仪技术检测CD34+的干细胞数为106～109 ml,在数字减影血管造影术(DSA)下行股动脉穿刺,导管超选择至闭孔动脉及旋股内外侧动脉,将干细胞悬液缓慢匀速注入动脉内.结果 30例患者随访18个月,根据综合疗效评定标准,治愈12例,显效11例,有效7例,总有效率达100%.结论 经动脉自体骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死可缓解临床疼痛,改善恢复关节功能,疗效肯定,是一种值得推广的治疗方法.     

永生化肝细胞移植治疗肝衰竭

目的: 观察永生化胎肝细胞及胚胎肝细胞经脾脏移植对D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用. 方法: 采用D-gal诱导大鼠急性肝衰竭,分3组进行治疗实验,Ⅰ组: 经脾脏移植永生化胎肝细胞2×107个;Ⅱ组: 移植原代胚胎肝细胞2×107个;Ⅲ组: 脾脏注射生理盐水1 mL,各组大鼠同时肌肉注射环孢霉素A(CsA) 10 mg/kg. 观察大鼠的存活率、肝脏功能、肝脏病理变化情况. 结果: Ⅰ组及Ⅱ组大鼠存活率均显著高于Ⅲ组大鼠(72.2% vs 22.2%, 61.1% vs 22.2%, P＜0.01),肝脏功能及肝脏病理均有改善, Ⅰ组与Ⅱ组之间大鼠存活率无明显差异(72.2% vs 61.1%, P＞0.05). 结论: 经脾脏移植胚胎肝细胞可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率,改善肝功能及肝脏病理,该永生化胎肝细胞可以成为肝细胞移植研究中的理想细胞材料.     

经皮穿刺经心外膜骨髓单个核细胞移植治疗犬严重缺血性心力衰竭

目的:探讨超声引导下,在犬缺血性心力衰竭模型经皮穿刺心外膜下心肌自体骨髓单个核细胞移植,修复心肌、再生血管、改善心功能的可能性、安全性及效果.方法:成年雄性家犬,体质量20～30 kg,经皮穿刺球囊封堵前降支建立犬心肌梗死模型手术后10 d,行超声心动图检查确立EF＜40%为严重缺血性心力衰竭(共14条).随机实验分组:细胞移植组(n=6)及生理盐水注入组(对照组,n=8).细胞移植术前1 d分离骨髓单个核细胞,以DAPI标记.23G超声引导穿刺针尾部连接电极,穿刺入心外膜下心肌,监测电极显示ST段抬高,即注入细胞悬液1.3×106/ml,改变方向,每一点分别注射0.2 ml,共10点.于术前及术后3个月行超声心动图及组织学检查.结果:荧光显微镜下可见到大量新生细胞,并可见发出绿色荧光的丝状肌丝肌管.光镜下见大量移植的单个核细胞生长,移植细胞间及与宿主细胞间均有闰盘连结.细胞移植组心肌梗死区域肉眼可见大量血管,小血管数量明显增加,心功能明显改善,与术前相比,每博输出量增加16.7 ml,EF增加14.7%,左室内径缩小6%.而对照组3个月后,梗死区室壁变薄,仅见纤维瘢痕组织,心腔扩大,心功能明显恶化.移植细胞组术中及术后均安全.结论:犬严重缺血性心力衰竭模型在超声引导下,经皮穿刺,经心外膜自体骨髓单个核细胞移植修复心肌、再生血管、改善心功能是可行、安全、有效的.     

神经干细胞移植治疗神经变性疾病的实验研究

目的:体外分离培养的胚胎大鼠神经干细胞(NSCs),移植入患有舞蹈症的转基因大鼠的纹状体内的存活、分化情况及对大鼠脑内多巴胺含量的影响.方法:无菌条件下剖腹取5只SD胚胎大鼠(孕15d)剥离出整个脑组织,进行体外神经干细胞的扩增培养,收集细胞悬液用自动微量注射器垂直刺入大鼠纹状体.结果:胚胎大鼠脑组织中分离的NSCs,可在体外稳定扩增,并且具有分化为神经元的能力,将标记的NSCs细胞悬液移植入大鼠纹状体,移植后5个月,免疫组化检测发现损伤的多巴胺神经元处显示酪氨酸羟化酶呈阳性的神经元.结论:在受损的纹状体移植入NSCs后,NSCs可被诱导分化为多巴胺神经元,进行功能重建.可见应用体外扩增的NSCs移植治疗神经性疾病是可行和有效的.     

经冠状动脉自体骨髓间充质干细胞移植治疗小型猪急性心肌梗死

目的评价经冠状动脉移植体外分离培养自体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗急性心肌梗死(AMI)的可行性及疗效.方法通过结扎冠状动脉左前降支90 min后恢复血流的方法建立AMI模型.采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞、传代培养后,在AMI造模10～14 d后将培养扩增的自体MSCs经冠状动脉植入梗死区,应用超声心动图观察移植前后心功能变化情况,冰冻切片荧光显微镜示踪4',6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记的MSCs,Ⅷ因子免疫荧光染色测定新生血管数目.结果MSCs生长呈纺锤样,生长旺盛呈旋涡样;DAPI标记率为l00%.AMI造模10～14 d后MSCs移植数量平均为(4～6)×107个,移植术后3个月,MSCs治疗组与对照组比较,左心室射血分数(LVEF)显著升高[(54.65±3.39)%vs(43.98±4.21)%(P＜0.01)],可见DAPI标记胞核为蓝色荧光的移植细胞,MSCs治疗组与对照组比较,新生血管数目显著升高[(13.28±4.39)vs(4.27 2.28)个,(P＜0.01)].结论通过体外培养扩增在短期内可以获得相当数量的生物性状稳定的MSCs,在AMI造模10～14 d后进行经冠状动脉MSCs自体移植,促进左室功能的恢复.MSCs移植与目前广泛运用的介入治疗相结合,方法简便、经济、有效,可望改善AMI患者的预后,具有良好的临床应用前景.     

小脑齿状核的形态学观察及临床意义

摘要 目的：明确小脑齿状核的形态和大小，为涉及齿状核的疾病的诊断和治疗提供解剖学基础。方法：通过对成人尸体小脑齿状核的剥制，观察齿状核的形态，测量齿状核的大小，并作统计学处理。结果：齿状核容积与小脑容积之比为0.6%~3.9%，左右齿状核形态大小相似，核长(18.12±3.78)mm，高(7.05±3.25)mm，宽(7.25±2.20)mm，核门朝向背内侧，核齿4个占55.6%，5个占44.4%。结论：提供齿状核的形态，显示齿状核的大小的参考值，为临床涉及齿状核的疾病的诊断和治疗提供依据。     

神经干细胞移植治疗遗传性小脑萎缩的临床研究

Objective:To study the clinical effect of neural stem cell transplantation in the treatment of inherited cerebellar atrophy (CA). Methods: The cells from human fetal cerebellum (8-10 weeks of gestation) were grown and expanded in vitro. The cultured neurospheres were then implanted into the dentate nuclei of patients by stereo tactic operation. Totally, 12 patients (7 males and 5 females with age ranging 22-62 years, mean 43 years) were treated by this operation from August 2006 to August 2008. Results: The cells of fetal cerebellum were expanded by 107folds in undifferentiated state in the culture. After the operation, no rejection was detected. Follow up, the effective rates were 58. 3% after 3 months, 75.0% after 6 months, and 66.7% for 12-24 months (mean 18 months). Conclusion: the transplantation of in vitro cultured neural stem cell is a feasible and effective treatment for inherited CA, but the long term effectiveness need to be taken in consideration.     

人胚神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：从流产人胚前脑中分离培养人胚神经干细胞。方法：神经干细胞具有自我复制和多向分化潜能。本实验利用神经干细胞特定的培养增殖培养体系分离纯化人胚神经干细胞，并对分离得到的神经干细胞的分子标记及分化潜能进行鉴定。结果：从8~10周龄流产人胚胎分离得到了神经干细胞，它能表达神经干细胞特异性抗原nestin，并能在体外诱导分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论：在人胚中枢神经系统中存在神经干细胞，并能够在体外扩增，为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为雪旺样细胞的方法

目的 :建立人骨髓间充质干细胞体外向雪旺样细胞定向诱导分化的方法。方法 :取健康人骨髓血标本 ,利用percoll(密度为 1.0 73 g·ml-1)分离骨髓单个核细胞 ,在DMEM LG + 10 % (体积分数 )FBS中培养 ,通过流式细胞术对培养细胞进行表型测定 ,对第 2、3、5、8代间充质干细胞进行定向诱导分化 ,用单抗S 10 0、神经胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillargacidicprotein ,GFAP) ,通过免疫组化方法对诱导的细胞进行鉴定。 结果 :经 percoll分离的间充质干细胞可传 16代 ,细胞数增加了大约 6× 10 7倍。流式细胞术结果显示 :percoll分离出来的未经培养的细胞 ,其CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 3 2 .4 7%± 3 .4 9% ,而培养后贴壁细胞中CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 94 .3 8%± 1.5 0 %。诱导后免疫组化染色结果显示 :由 β ME +bFGF预诱导、β ME +bFGF诱导的S 10 0阳性细胞最多 ,可达 90 %± 4 % ,GFAP阳性细胞为 2 1%± 5 %。结论 :人骨髓中间充质干细胞能定向诱导分化成雪旺样细胞。     

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究。     

人造血干细胞在山羊体内的移植和扩增及分化研究

目的　建立人 /山羊异种造血干细胞 (hematopoieticstemcell,HSC)移植模型 ,在活体水平研究人HSC移植后的扩增和分化。方法　分离人脐血HSC ,然后将其 (1× 10 5)经母羊子宫注射入胎龄为 5 5～ 6 5d的胎山羊体内 ,出生后在不同阶段应用FACS、PCR和PCR southern杂交技术 ,分析人HSC在山羊体内的扩增和分化情况。结果　在 5 0头受试胎羊中 ,39头足月分娩 ,其中 35头山羊呈现人血细胞嵌合 ,人造血细胞在山羊血液中的比率平均达到 1%～ 3% ,并稳定地保持到 10个月以上 ,山羊体内的人造血细胞表达CD34、CD14、CD2 0和血型糖蛋白A(GPA) ,但CD3、CD4、CD7、CD8和CD5 6未见表达或表达很低。结论　人HSC在山羊体内能有效地扩增至 10 0 0～ 10 0 0 0倍 ,并呈现出有限的分化。人 /山羊HSC异种模型为在活体探讨HSC移植、扩增和分化提供了科学资料     

转基因神经干细胞移植治疗暂时性脑缺血的实验研究

目的探讨转染血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的神经干细胞在宿主缺血区的基因表达情况,以及对神经功能的保护作用.方法用脂质体介导法将VEGF121基因转染到大鼠神经干细胞中.经RT-PCR及免疫荧光染色检测转基因神经干细胞及其分化细胞的基因表达情况.建立大鼠大脑中动脉梗塞模型(tMCAO),并将其随机分成(1)对照组,(2)细胞悬液PBS移植组,(3)神经干细胞移植组,(4)转基因神经干细胞移植组,前3组每组10只大鼠,第4组20只大鼠.立体定向法将BrdU标记的转基因神经干细胞移植到tMCAO大鼠的纹状体缺血半暗区.移植后2～12周进行神经损害严重程度评分(NSS)并与其他3组比较.用免疫荧光染色方法观察移植后1周转基因神经干细胞在脑内的基因表达情况和移植后12周转基因神经干细胞在脑内的分化、迁徙情况.结果转基因神经干细胞及其分化的子代细胞均有VEGF121的表达并持续2周左右.移植后2、4、6、8、10、12周(4)组大鼠的NSS评分分别为5.8±1.5、5.0±1.0、4.6±1.0、4.0±0.7、4.0±1.0、3.8±0.4,均低于其他3组.其中第8周显著低于(1)、(2)组(均P=0.008),第12周显著低于(1)、(2)、(3)组(均P=0.000).转基因神经干细胞移植后1周在宿主脑内迁徙并表达VEGF基因产物,移植后12周在宿主脑内存活、迁徙,部分分化成神经元.结论转染VEGF基因的神经干细胞移植后在缺血早期表达基因产物,并对宿主局部血管和神经结构具有保护作用.转基因神经干细胞移植是治疗脑缺血性疾病的可行途径.     

人胚神经干细胞的冻存与复苏

目的：研究神经干细胞浆存复苏后的成活率及再培养生长情况。方法：利用无血清培养基短期体外培养胚胎来源的神经干细胞后，以冻存液（体积分数为70％DMEM／F12，体积分数为20％胎牛血清，10％DMSO）进行冻存，于1周，4周，8周，12周，16周，20周，24周分别复苏，计活细胞比例并进行再培养。结果：复苏后神经干细胞的成活比例分别为68％、65％、65％、62％、61％、60％、60％，再培养生长良好。结论：本实验对神经干细胞成功地进行了冻存，复苏和再培养，对临床择期进行神经干细胞移植手术和建立“神经干细胞库”具有重要的意义。     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

Experimental Study on Treatment of Glioma by Embyonic Neural Stem Cell Transplnation in Rats

The neural stem cells in Wistar rats were cultured in vitro,purified,and transplanted into C6 glioma model in order to observe their biological characters and provide a basic foundation for treatment of neurological diseases by neural stem cell transplantation.The cells at hippocampal area from gestation 15-day rats were cultured in vitro,and frozen and preserved in liquid nitrogen.C6 tumor-bearing models(n=25) and neural stem cells transplantation models(n=35) were established.When the tumor grew to 3 to 4 weeks,5 rats in each group were randomly selected for MRI examination.At different intervals,the rats were perfused and sampled for HE staining,GFAP and BrdU immunohistochemical staining.The results showed that after resuscitation of neural stem cells at 1-4 passages,the cell viability was 40%-63% with the difference being not significant.The cells could proliferate,passage,and most cells transplanted into glioma model survived.The mean survival time in neural stem cell transplantation group and control was 4.28 and 3.88 weeks respectively,and the average tumor size in the former was smaller than in the latter.It was concluded that embryonic neural stem cells in rats could proliferate and differentiate,and after resuscitation the biological characteristic and viability of the cells were not influenced.Neural stem cells had inhibitory effects on the growth of glioma cells and could prolong the survival of rat model.