肝癌患者自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗后免疫活性细胞的检测及其临床意义

目的　观察肝癌患者自体细胞因子诱导杀伤细胞 (CIK细胞 )回输后 ,外周血中T细胞亚群及树突状细胞亚群的变化 ,评价CIK细胞治疗肝癌的临床效果。方法　采用成份血采血机采集13例肝癌患者的外周血单个核细胞 (PBMC) ,经多种细胞因子诱导后 ,于培养的第 4、7、10、13、15天流式细胞仪检测细胞表型 ;CIK细胞回输前及回输后取病人外周血 ,流式细胞仪测定Ⅰ型树突状细胞(DC1)和Ⅱ型树突状细胞 (CD2 )的比例。结果　诱导培养后 ,CD3+ CD8+ ,CD3+ CD5 6 + ,CD2 5 + 效应细胞的比例明显升高 ,分别由最初的 33 5 %± 10 1%、7 7%± 2 8%和 12 3%± 4 5 % ,上升至 36 6 %±9 0 %、18 9%± 6 9%和 16 4 %± 5 9% ,其中CD3+ CD8+ 可维持较高水平 ,CD2 5 + 和CD3+ CD5 6 + 比例分别于培养后的第 7天和第 13天开始下降。CD3+ CD4 + 和NK细胞比例略有下降 ,但差异无显著意义。CIK细胞回输后DC1和CD2细胞亚群的比例明显升高 ,分别由回输前的 0 5 9%± 0 2 3%和0 2 6 %± 0 12 %上升至回输后的 0 85 %± 0 2 7%和 0 4 3%± 0 2 0 %。CIK细胞治疗后患者临床症状明显改善 ,无明显副作用。结论　CIK细胞治疗可以提高肝癌患者的细胞免疫功能 ,提高对肿瘤细胞的杀伤作用。     

壳聚糖载体加载碱性成纤维细胞因子诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的研究

利用生物材料在体外将骨髓间充质干细胞诱导为神经元样细胞。方法利用全骨髓贴壁培养法提取骨髓间充质干细胞,并利用细胞表面抗原CD45 和CD90 进行鉴定。分为3 组,单纯壳聚糖组、加载了碱性成纤维细胞因子（bFGF）的壳聚糖组和单纯bFGF组。分别在3 和7 d 时利用免疫荧光细胞化学检测神经干细胞标记蛋白Nestin、幼稚神经元标记蛋白Tuj-1 等指标的表达情况。结果加载了bFGF 的壳聚糖处理细胞时,细胞在第3 天出现了大量的Nestin 阳性细胞,虽然在其他两组中也出现了Nestin 阳性细胞,但加载了bFGF的壳聚糖组比其他两组多,且差异有统计学意义（ p<0.05）。同样的,在诱导7 d时,Nestin 和Tuj-1 双阳性的细胞在加载了bFGF 组中的比例要比其他两组要多,且差异有统计学意义（ p<0.05）。结论加载有bFGF的壳聚糖能够将成年大鼠骨髓间充质干细胞高比例诱导分化为神经元样细胞。为骨髓间充质干细胞自体移植治疗神经退行性疾病和中枢神经系统提供了理论和实验依据。     

六味地黄丸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的:观察滋补肝肾中药六味地黄丸体外诱导大鼠BMSCs分化为神经元样细胞的作用,为进一步探索获得较高比例神经元样细胞的诱导方法打下基础。方法:采用全骨髓贴壁分离法分离、培养SD大鼠BMSCs,鉴定后的第3代细胞经bFGF预诱导24 h后按空白组、bFGF组、六味地黄丸组进行诱导,观察细胞形态变化,诱导培养7 d,采用免疫细胞化学染色法检测相关标志物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果与结论:bFGF组、六味地黄丸组部分细胞逐渐伸出突起,多为2~3极,呈现较典型的神经元样细胞形态;均有Nestin、NSE、GFAP阳性表达,六味地黄丸组Nestin、NSE表达阳性率高于bFGF组,差异有统计学意义(P0.05)。结果说明:(1)全骨髓贴壁分离法分离、培养的骨髓间充质干细胞能逐渐纯化,细胞活性较高,生物学性状稳定,适于做进一步研究;(2)六味地黄丸能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,可继续探讨六味地黄丸和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导是否可获得更高比例的神经元样细胞。     

CD34+细胞体外定向诱导分化的实验研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对CD34+细胞体外定向诱导分化作用.方法:应用阴性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC),在液体培养体系加入不同组合细胞因子对CD34+细胞进行诱导,检测细胞总数、CD71+细胞和CD15+细胞比例及粒单系祖细胞和红系祖细胞扩增数量.结果:液体培养体系中,以FL+Tpo+SCF+IL-3+Epo细胞因子组合对CD34+细胞向红系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD71+细胞比例为61.20%±5.31%,BFU-E、CFU-E分别扩增27.12±3.95和30.65±40.26倍.以FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF细胞因子组合对CD34+细胞向粒系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD15+细胞比例为56.18%±6.57%,CFU-GM扩增29.87±10.52倍.结论:合理组合生长因子,可定向诱导CD34+细胞生成大量血细胞,将有助于满足临床应用的需要.     

慢性粒细胞白血病骨髓细胞体外培养净化作用实验研究

目的 :采用 FISH方法直接在干细胞水平对慢性粒细胞白血病 (CML )患者自体骨髓体外培养前后的间期细胞进行 bcr/abl融合基因检测 ,从而探讨 CML 骨髓细胞体外培养对自体骨髓移植物的净化作用。方法 :分离初治的慢性期 Ph+ CML 7例骨髓单个核细胞 (MNCs) ,体外培养 10 d,用免疫磁珠 (MACS)富集培养前后的 CD34+ 细胞 ,通过流式细胞仪检测培养前后 MNCs中 CD34+ 干细胞比例 ,然后用 FISH方法检测其中 bcr/abl融合基因 ,同时分别用正常人细胞及 K5 6 2细胞株作阴性及阳性对照。结果 :(1) 7例患者骨髓细胞培养前后 CD34+ 细胞中 bcr/abl融合基因平均检出率分别为 85 .3%± 4 .9%和 78%± 5 .1% ,有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,(2 )培养前培养体系中 CD34+ 细胞数量为 (6 .0 6 0± 1.5 6 4 )× 10 5个 ,培养后体系中的 CD34+细胞数量为 (5 .974± 1.4 2 4 )× 10 5个 ,两者无明显差异 (P>0 .0 5 )。 (3)在对照组中假阳性率为 2 .5 % ,假阴性率为 2 %。结论 :自体骨髓细胞体外培养对 CML 病人的骨髓肿瘤细胞有一定程度的净化作用 ;FISH技术直接在干细胞水平检测 bcr/abl融合基因 ,且能定量分析 ,较传统方法更适合对骨髓净化进行评价 ,为骨髓净化提供了一种更方便、可靠的评定方法     

骨髓间充质干细胞作为胰腺癌基因治疗载体的实验研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞对胰腺癌的聚集作用。方法:体外分离培养纯化绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞,通过Transwell共培养体系观察骨髓间充质干细胞向胰腺癌细胞PNAC-1的迁移;建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型,经尾静脉回输骨髓间充质干细胞至荷瘤鼠体内,荧光显微镜动态观察肿瘤组织及其他脏器组织中骨髓间充质干细胞的分布及含量。结果:通过贴壁培养获得小鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测证实,CD44+CD45-、CD90+CD45-细胞均占细胞总数90%以上;Transwell共培养提示骨髓间充质干细胞向胰腺癌细胞PANC-1迁移,且随着肿瘤细胞数的增多,细胞迁移的数量增多(P<0.05);体内实验证实,骨髓间充质干细胞向胰腺癌组织特异性地靶向聚集,10 d内随着时间的延长骨髓间充质干细胞在胰腺癌组织中逐渐增多(P<0.05),10 d后增加不明显。结论:小鼠骨髓间充质干细胞体外向胰腺癌细胞迁移,体内向胰腺癌组织靶向聚集。     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

慢性髓性白血病骨髓细胞体外培养净化的实验研究

目的 :探讨慢性髓性白血病 (CML)骨髓细胞体外培养对自体骨髓移植物的净化作用。方法 :分离 10例初诊的慢性期Ph+ CML患者骨髓单个核细胞 (MNC) ,体外培养 10天 ,利用染色体分析法检测培养前后Ph+ 中期细胞比例 ;通过流式细胞术检测培养前后MNC中CD+ 3 4干 /祖细胞比例。结果 :培养后Ph+ 中期细胞比例下降明显 (5 7%±6 92 % )vs(88.2 %± 7.97% ) ,P <0 .0 5 ;培养体系MNC中CD+ 3 4干 /祖细胞数量减少无显著性 (2 .78± 1.6 7)× 10 5 vs(3 2 7± 2 .2 5 )× 10 5 ,P >0 .0 5。结论 :CML骨髓细胞经体外培养 ,Ph+ 细胞比例下降 ,而CD+ 3 4干 /祖细胞数量无明显变化 ,提示该法对CML骨髓细胞具有一定程度净化作用。     

神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的时间效应

目的 探讨培养于诱导分化液中不同时间的大鼠神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的效应.方法 大鼠神经干细胞球在含有细胞因子IL-1、IL-11、GDNF和LIF的诱导分化液中分别培养2、4、6、8的10 d后,流式细胞仪检测其体外诱导分化成多巴胺能神经元的分化率.结果 在诱导分化液中大鼠神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,多数细胞有1、2个长突起或有多个短突起.免疫组织化学显示分化的细胞中含有TH阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2、4、6、8和10 d的神经球分化成TH阳性细胞比率分别为(3.2%±0.9%)、(6.8%±1.6%)、(16.7%±2.6%)、(14.8%±1.8%)和(12.2%±2.5%).结论 大鼠神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元存在着分化的时间效应,诱导分化6d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比率最高.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性.方法:用密度为1.073 kg/L的细胞分离液分离骨髓间充质干细胞.取第3代培养细胞用含0.1 μmoL/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的成骨细胞分化培养液培养.于培养7,14 d取细胞爬片做改良的Gomori钙钴法碱性磷酸酶染色,21 d做Von Kassa染色;脂肪细胞分化培养用含10 mg/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.25 mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤和100 μmol/L吲哚美辛的培养液诱导培养,于诱导3,7 d取细胞爬片做油红0染色.用含1mmol/L β-巯基乙醇和150 mL/L FBS的DMEM培养基先预诱导分化24 h.再用含有5 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM无血清培养基诱导分化5 h.做神经元特异性烯醇化酶、角质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白免疫组化染色.结果:在加入成骨细胞分化培养液后7和14 d钙钴法碱性磷酸酶染色阳性细胞百分率分别为11.5%和37.5%.21 d的细胞爬片Von Kassa染色显示钙盐沉积.在脂肪细胞诱导3和7 d分别得到22%和90.33%油红O染色阳性细胞.5 h神经细胞诱导分化后NSE免疫组化染色阳性率为33%,NF-200阳性细胞率为37.5%,GFAP染色阴性.结论:骨髓间充质干细胞在体外可定向加药诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞.     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性

目的：建立一种成人骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增的方法，并探讨其部分生物学活性及向脂肪细胞诱导分化的方法，并以此鉴定所获细胞。方法：采用1．073g／ml的Percoll分离液分离成人骨髓间充质干细胞。接种于纤维连接蛋白包被，含有表皮生长因子和血小板原性生长因子BB的2％胎牛血清培养液中，并利用其贴壁性进行纯化；观察其形态学变化及超微结构，流式细胞仪检测其表面标记物；采用10％胎牛血清和尼克酰胺诱导其向脂肪细胞的分化。结果：原代和传代培养均保持较强的增殖能力，超微结构显示了干细胞的幼稚特性，流式细胞仪检测示CD34、CD45、CD19、组织相容性抗原-DR阴性，CD44、CD10、CD29、CD13阳性。体外能够分化成为脂肪细胞，油红O染色阳性。结论：采用该方法骨髓间充质干细胞生长稳定，扩增较快；一定条件下能够定向分化成为脂肪细胞；我们所获得的细胞具有间充质干细胞的特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养及初步鉴定

目的探讨并建立一种简便有效的体外分离纯化及扩增大鼠骨髓间质干细胞的方法,并研究其生物学特性,对其进行初步鉴定,为进一步诱导分化为胃黏膜上皮细胞奠定基础。方法利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,传代扩增,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,并用免疫组化方法鉴定骨髓间质干细胞表面CD29,CD44,CD34的表达。将加入成骨、成脂肪诱导剂的骨髓间质干细胞体外培养2～3周,观察细胞形态变化,并做油红0染色,鉴定成骨及成脂肪分化的结果。结果原代培养8—10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3～4d。免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性,且可以将其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用贴壁培养法可分离培养出大量大鼠骨髓间质干细胞,且此方法简便易行。     

体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化

目的:观察体外雪旺细胞环境对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的诱导分化作用。方法:分离和体外培养新生大鼠MSCs和雪旺细胞;实验组MSCs经DAPI标记后与雪旺细胞按1∶2比例共培养,观察细胞的形态变化,在第1,3,6天时使用免疫细胞化学染色检测MSCs中Nestin,GFAP及S-100表达。对照组MSCs单独培养,其余处理与实验组相同。结果:共培养1 d后部分MSCs出现雪旺细胞样形态,Nestin表达率为(83.4±3.5)%,随时间增加而降低。GFAP及S-100表达率随时间而增加。对照组细胞形态无变化,不同时间点均有少量MSCs表达Nestin,而GFAP和S-100未见表达。结论:MSCs可通过体外共培养向雪旺细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

筛选后的巢蛋白阳性细胞流式鉴定及诱导分化

目的观察胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞(符合医学伦理学)是否具有与间充质干细胞类似的表面标志以及多向分化的潜能.方法从胎儿胰腺中分离的巢蛋白阳性细胞筛选后进行扩增,用流式细胞仪分析表面标志,并探讨这类细胞的成脂和成骨的分化潜能.结果筛选纯化后的巢蛋白阳性细胞的表面标志与骨髓间充质干细胞表面标志相似:此类细胞可在体外诱导为脂肪细胞或骨细胞.结论筛选纯化的胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞具有一定间充质干细胞的特性.     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

Differentiation of mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron-like cells in vitro

INTRODUCTION The therapy of Parkinson’s disease is difficult, sopeople have been exploring more effective methods.Drugs can only treat symptoms of the diseases, andbrain tissue transplantation has been the most prosp-ective way, but the sources of transplantation cells needto be explored. The people have a new viewpoint ofthe central nervous system (CNS) regeneration andthe therapy of CNS diseases[1,2] because of the recentdiscovery of stem cell populations in CNS. But adultneura…