hBcl-2和hVEGF165双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的 基因的表达及表达产物的生物学效应.方法 贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的 基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双...     

VEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究

目的以hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞移植治疗兔激素性股骨头坏死模型,通过影像学观察、病理学及免疫组织化学检查等方法评价疗效。方法使用马血清与醋酸泼尼松龙制备兔激素性股骨头缺血性坏死动物模型后分为4组,分别进行以下治疗：A组（不作任何处理）;B组（髓心减压＋自体骨移植）;C组（髓心减压＋骨髓间充质干细胞＋自体骨移植）;D组（髓心减压＋Ad-VEGF165转染骨髓间充质干细胞＋白体骨移植）。术后3周处死行病理学、免疫组织化学检查及Western Blot检测股骨头内VEGF的表达,比较各组间的差异。结果D组在软骨下血管、VEGF阳性面积百分比、股骨头内VEGF的相对浓度均高于其他各组;在VEGF平均灰度值、空骨陷窝率低于其他各组,且各组间差异有统计学意义。结论转染了Ad—VEGF165的骨髓间充质干细胞在宿主股骨头局部可以表达VEGF蛋白,且较单纯的骨髓间充质干细胞移植表达的强度更高,对激素性股骨头坏死进行早期治疗具有确切疗效。     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），测定其生长曲线和表面标志CD34，CD44，CD45及SH3，检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后；用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs，观察转染后细胞形态和生长状况，通过RT-PCR，Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性，CD45和CD34阴性，可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞；经RT-PCR，Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs，并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

VEGF165基因重组腺相关病毒构建及转染猪骨髓间充质干细胞的研究

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）的重组腺相关病毒载体,在体外转染猪骨髓间充质干细胞并观察其表达。方法细胞AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen及含hVEGF的质粒经EcoRI＋BamHI双酶切、连接,构建pAAV-hVEGF165-IRES-ZsGreen载体,采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获得rAAV2-hVEGF165及对照重组腺相关病毒,real-timePCR法测定病毒效价。Westernblot检测重组rAAV2-hVEGFl65在猪骨髓间充质干细胞的表达,MTS法检测VEGF蛋白活性。结果成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,rAAV2-hVEGFl65经双酶切和测序鉴定正确,real-timePCR法测定病毒效价为5×10 12vg／ml。转染rAAV2-hVEGF165的猪骨髓干细胞能够有效表达VEGF蛋白,并能促进血管内皮细胞的增殖。结论成功构建rAAV2-hVEGFl65重组腺相关病毒载体,并能在猪骨髓间充质干细胞中有效转染和表达,为进一步探索rAAV2-hVEGF165对治疗缺血性心肌疾病的研究提供实验基础。     

移植的骨髓间充质干细胞在兔腰椎间盘内分化的研究

目的观察移植的骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内分化的情况。方法从兔骨髓中分离和培养骨髓间充质干细胞,用核标记物BrdU标记后注入到兔的椎间盘中,8周后取材采用双染的方法检测移植骨髓间充质干细胞的细胞质中Ⅱ型胶原蛋白的表达情况。结果移植后的骨髓间充质干细胞部分双染呈阳性显色,即胞质内含有Ⅱ型胶原蛋白,向软骨细胞方向分化。结论在椎间盘环境的影响下骨髓间充质干细胞可以分化为软骨样细胞。     

hBMP-2真核表达载体的构建及转染兔骨髓间充质干细胞的表达

目的:构建pcDNA3.1-hBMP2真核表达质粒并检测其在兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形成蛋白-2(hBMP2)基因片段,构建成pcDNA3.1-hBMP2重组质粒.转染兔骨髓间充质干细胞并通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.结果:本实验构建的重组质粒目的基因片段为hBMP2-cDNA.经RT-PCR和免疫组化证实,转染pcDNA3.1-hBMP2后的兔骨髓间充质干细胞内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达.结论:本实验成功构建hBMP2真核表达质粒并在骨髓间充质干细胞中得到表达,为进一步研究用BMP2基因转染的方法来加速牵张成骨新骨形成奠定了基础.     

移植过表达人VEGF165的BMSCs促进放疗损伤大鼠模型的组织修复

背景 骨髓间充质干细胞（BMSCs）的多向分化潜能在组织再生的研究应用中显示出了极大的潜力,同时血管内皮生长因子165（VEGF165）能够促进血管的生成从而促进组织的再生。本研究用VEGF165基因修饰BMSCs移植的方法来恢复放疗大鼠损伤模型的组织修复能力。 方法 从大鼠胫骨分离获取BMSCs;用脂质体将hVEGF165转染至BMSCs;以60Coγ射线照射大鼠右后肢,总吸收剂量为30 Gy,总共40只,照射结束后第1天,将实验分为四组（n=10）：不注射组作为未治疗对照组（组1）,空转染BMSCs组（组2）、未转染BMSCs组（组3）及hVEGF165-BMSCs组（组4）,分别注射照射区组织,共治疗2次,间隔2周。治疗结束1周后行血管造影及血管染色体视学图像分析,对后肢肌肉标本行血管、肌肉显微结构观察、RT-PCR、Western Bloting及免疫组化染色。 结果 结果表明分离得到的BMSCs具有多向分化能力;转染后的BMSCs高表达hVEGF165基因和蛋白;组2、3、4的血管数量、密度、平均管径、平均截面积各项指标及MyoD、myogenin、α-SMA蛋白、CD31蛋白表达均高于组1。hVEGF165mRNA及蛋白的表达及上述指标在注射hVEGF165转染的BMSCs（组4）均高于组2和组3。 结论 过表达VEGF165基因的BMSCs通过促进血管新生和肌纤维的再生有效地增强了组织的修复能力,过表达VEGF165基因的BMSCs具有潜在的临床应用价值。     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

pcDNA3-EGEP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨外源性pcDNA3-EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞的可行性.方法用增荧光绿色蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)cDNA作为报告基因,采用重组真核表达载体系统(pcDNA3-EGFP)以脂质体法转染原代骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响.结果经荧光显微镜下观察证实成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染,持续表达时间超过8周;没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响.结论采用真核转染技术可以介导外源基因转染骨髓间充质干细胞,为今后采用基因增强组织工程方法治疗肌肉、骨骼系统疾病提供了实验基础.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs），观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞；用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞；以MTT测定诱导细胞的增殖活性；免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达；诱导后的细胞移植于白兔膝关节内，X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化，且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高，移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

目的 体外诱导兔骨髓间充质干细胞向肌源性细胞分化,并观察血管内皮生长因子AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后的表达。方法 将20只兔随机分为对照组和实验组,从骨髓液中分离MSCs,对照组以低糖DMEM培养,实验组加用5-氮胞苷(10 mmol/L)诱导培养,第28天进行肌钙蛋白I免疫组化染色。另构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒,通过脂质体转染对照组MSCs,用Northern blotting和Western blotting鉴定血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并用ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度。结果 成功分离培养出兔MSCs,实验组经5-氮胞苷诱导后MSCs向肌源性细胞分化,肌钙蛋白I免疫组化染色阳性。成功构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒并通过脂质体转染MSCs,Northern blotting示转染的MSCs VEGF165表达信号明显强于未转染细胞,Western blotting 示转染VEGF165基因的MSC表达VEGF,ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度在转染后第3天(1 011 pg/ml)和第5天(1 027 pg/ml)达高峰,此后逐渐下降,但至第13天(349 pg/ml)仍显著高于空白对照(116 pg/ml)和pAdTrackCMV组(125 pg/ml),P<0.01。结论 兔骨髓间充质干细胞可在体外向肌源性细胞分化,转染VEGF基因可表达VEGF,有望将干细胞移植和基因治疗结合以治疗缺血性心脏病。     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

OBJECTIVE: To induce the differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into myogenic cells in vitro, and to investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene in AdTrackCMV-hVEGF165- transfected MSCs. METHODS: Twenty rabbits were divided equally into control group and experimental group, and MSCs were isolated and purified from their bone marrow by Percoll (1.073 g/ml) followed by cell culture in low-glucose DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. 5-azacytidine (5-Aza) was added into the cell culture of the experimental group on the third day. The expression of troponin I in MSCs was assayed by immunohistochemistry on the 28th day. AdTrackCMV- hVEGF165 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into the MSCs, and subsequent VEGF expression was detected by Northern blotting and Western blotting while enzyme-linked immunosorbent assay (ILISA) was employed to examine the VEGF concentration in the supernatant of the culture medium. RESULTS: Following successful isolation and culture of the MSCs from rabbit bone marrow, 5-Aza-induced differentiation of the cells into myogenic cells was demonstrated by their positive staining for cardiac troponin I (cTnI). Northern blotting showed that the expression of VEGF 165 mRNA was much higher in the VEGF165 gene-transfected cells than in the control cells. Western blotting showed VEGF expression in the transfected cells. The concentration of VEGF in the supernatant mounted to the peak level 3-5 d after VEGF165 gene transfection (1,011-1,027 pg/ml) and decreased gradually thereafter, but still maintaining higher levels than those in the control group and pAdTrackCMV group (349 pg/ml vs 116 pg/ml and 125pg/ml, respectively, P<0.01). CONCLUSION: MSCs can be induced to differentiate into myogenic cells in vitro and express VEGF after VEGF gene transfection, and this success may provided a basis for combining MSC transplantation with gene therapy for regeneration of the damaged myocardial cells.     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨经腺病毒表达载体转染血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)体内外基因表达的特点。方法构建VEGF基因腺病毒表达载体,将VEGF165基因转染到MSCs中。用RT-PCR法检测转基因MSCs中基因表达情况。结果转基因MSCs及其分化的子代细胞均有VEGF165的表达,并持续2周左右时间。结论经腺病毒表达载体转染VEGF165基因的MSCs在体内外均有良好的基因表达。     

CO-TRANSFECTION OF RAT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS WITH HUMAN BMP2 AND VEGF165 GENES

Objective To explore the feasibility and efficacy of lentivirus-mediated co-transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene and human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene. Methods The hVEGF165 and hBMP2 cDNAs were obtained from human osteosarcoma cell line MG63 and cloned into lentiviral expression vectors designed to co-express the copepod green fluorescent protein (copGFP). The expression lentivector and packaging Plasmid Mix were co-transferred to 293TN cells, which produced the lentivirus carrying hVEGF165 (Lv-VEGF) or hBMP2 (Lv-BMP), respectively. MSCs of Wistar rats were co-transfected with Lv-BMP and Lv-VEGF (BMP+VEGF group), or each alone (BMP group and VEGF group), or with no virus (Control group). The mRNA and protein expressions of hVEGF165 and hBMP2 genes in each group were detected by real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral expression vectors carrying hVEGF165 or hBMP2 were correctly constructed and confirmed by restriction endonucleses analysis and DNA sequencing analysis. A transfer efficiency up to 90% was archieved in all the transfected groups detected by the fraction of fluorescent cells using fluorescent microscopy. From the results generated by real-time PCR and ELISA, VEGF165 and BMP2 genes were co-expressed in BMP+VEGF group. No significant difference of BMP2 expression was detected between BMP+VEGF and BMP groups (P>0.05). Similarly, there was no significant difference of VEGF165 expression between BMP+VEGF and VEGF groups (P>0.05). Conclusion VEGF165 and BMP2 genes were successfully co-expressed in MSCs by lentivirus-mediated co-transfection, which provided a further foundation for the combined gene therapy of bone regeneration.     

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

 【目的】 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22 细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】 PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165 慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。     

血管内皮生长因子的基因克隆与表达

目的　构建编码正反义血管内皮生长因子 1 65(vascularendothelialgrowthfactor 1 65 ,VEGF1 6 5)的真核表达质粒 ,观察质粒转染体外培养的人脐静脉血管内皮细胞 (humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)后 ,靶细胞VEGF的分泌及细胞生长速度是否发生改变。方法　RT PCR从人胚胎肾组织中获hVEGF1 6 5的cDNA片段 ,构建编码正反义hVEGF1 6 5真核表达质粒 (pCR3 .1 /anti VEGF1 6 5及 pCR3 .1 /VEGF1 6 5) ,通过脂质体介导将质粒转入HU VEC细胞 ,ELISA测定转染后细胞VEGF的分泌量 ,设空载体组及未转染的细胞为对照。筛选稳定表达外源基因的细胞克隆 ,在相差显微镜及透射电镜下观察转染后细胞形态是否发生变化 ,MTT方法检测细胞生长曲线是否有改变。结果　DNA测序结果 ,获得重组质粒pCR3 .1 /anti VEGF1 6 5与pCR3 .1 /VEGF1 6 5所携带的外源基因序列与文献报道的基本一致。质粒转染后靶细胞形态均无明显变化 ,仅在透射电镜下观察到与蛋白质合成相关的细胞器结构发生了相应的改变。反义VEGF转染明显降低靶细胞VEGF的分泌量 ,抑制率为 67.7% (P <0 .0 1 ) ,同时细胞生长速度明显减慢 (P <0 .0 5)。而转入正义基因的细胞VEGF的分泌量则能明显提高 ,与空白对照组比较增长率为984.8% (P <0 .0 1 ) ,细胞生长速     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.