血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染骨髓内皮祖细胞后VEGF165的表达

目的:培养和鉴定大鼠内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),观察pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染大鼠骨髓内皮祖细胞后内皮细胞生长因子165(Vascular endot-helial growth fator-165,VEGF165)的表达.方法:体外培养内皮祖细胞,以免疫细胞化学法检测其表面抗原(CD34、CD133、KDR)的表达.通过pcDNA3.1(+)质粒转染VEGF165后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测内皮祖细胞培养上清液中VEGF蛋白的水平,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮祖细胞中VEGF165mRNA的表达.结果:免疫细胞化学检测表明培养的细胞为大鼠内皮祖细胞,PCR后凝胶电泳显示pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组在576 bp处可见有明显条带,pcDNA3.1(+)空质粒转染组和未转染组可见微弱的电泳带位于500 bp与600 bp之间,约576bp大小.ELISA检测结果为pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组上清液中VEGF165水平为(175.8±10.7)pg/ml,pcDNA3.1(+)空质粒组为(10.5±1.6)pg/ml,未转染组为(9.3±1.3)pg/ml.结论:内皮祖细胞体外培养有微量VEGF165表达,应用pcDNA3.1(+)/VEGF165载体转染,可使SD大鼠内皮祖细胞高效表达VEGF165.     

VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨经腺病毒表达载体转染血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)体内外基因表达的特点。方法构建VEGF基因腺病毒表达载体,将VEGF165基因转染到MSCs中。用RT-PCR法检测转基因MSCs中基因表达情况。结果转基因MSCs及其分化的子代细胞均有VEGF165的表达,并持续2周左右时间。结论经腺病毒表达载体转染VEGF165基因的MSCs在体内外均有良好的基因表达。     

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

血管内皮生长因子基因在兔骨髓间充质干细胞中的转染和表达

目的：探讨应用人血管内皮生长因子165 (hVEGF₁₆₅)进行基因修饰的可行性，为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法：构建pcDNA3.0-VEGF₁₆₅真核表达载体，利用脂质体介导转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），ELISA方法检测转基因MSCs的hVEGF蛋白表达情况，MTT法检测转基因MSCs表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响，设单纯培养MSCs及pcDNA3.0转染MSCs组为对照组。结果：成功构建hVEGF真核表达载体，并成功地将其转入MSCs中；MSCs细胞在转染 pcDNA3.0-VEGF₁₆₅ 质粒24、48和72 h后，其培养上清中hVEGF蛋白表达量均较对照组显著升高（P<0.05），至G418筛选后12代，转基因MSCs培养上清中仍有hVEGF蛋白的表达，含2%、4%、8%、16%和32%转基因细胞培养上清的培养液均明显增加血管内皮细胞的增殖率，与对照组比较，差异均具有显著性（P<0.05）。 结论： hVEGF₁₆₅基因成功地转染至MSCs中，并可进行有效地表达。     

超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法：采用超声辅助电穿法，将VEGF165基因的质粒PEGFP—Cl转染至骨髓间充质干细胞，转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果：超声辅助转染5h后可见细胞内有GFP表达，10h后可达高峰。结论：VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞内有GFP表达，提示细胞转染成功，骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

小鼠骨髓基质干细胞体外分化为前体心肌细胞的初步实验

目的 研究体外诱导小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的可能性。方法 MSCs通过细胞传代培养,并通过流式细胞仪进行鉴定。MSCs经过5-杂氮胞苷诱导后,通过RT-PCR、半定量RT-PCR、Western-blotting和透射电镜检测诱导后的MSCs。结果 培养的MSCs为形态均一的梭形细胞,有时可见细胞融合。流式细胞仪显示诱导后的MSCsCD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45表达阴性。经过5-杂氮胞苷诱导后的MSCs表达Nkx2-5/Csx、GATA4、β-MHC基因和α-sarcomericactin和desmin蛋白,透射电镜显示诱导后的MSCs有肌丝形成。诱导后的MSCsDNA甲基化转移酶表达降低。结论 小鼠MSCs能够向前体心肌细胞分化。     

hVEGF165在自体骨髓间充质干细胞移植治疗兔缺血后肢中的表达

目的 观察hVEGF165在自体骨髓间充质干细胞移植治疗兔缺血后肢中的表达.方法 体外培养兔骨髓问充质干细胞,通过腺病毒载体转染hVEGF165基因.移植后4周内,采用RT-PCR法鉴定hVEGF165在兔缺血后肢中的表达.结果 hVEG165成功转染骨髓间充质干细胞,移植后在兔缺血后肢中有效表达.结论 hVEGF165转染干细胞后能在体内有效表达.     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性.方法制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性.结果VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性.结论VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF.     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

OBJECTIVE: To induce the differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into myogenic cells in vitro, and to investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene in AdTrackCMV-hVEGF165- transfected MSCs. METHODS: Twenty rabbits were divided equally into control group and experimental group, and MSCs were isolated and purified from their bone marrow by Percoll (1.073 g/ml) followed by cell culture in low-glucose DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. 5-azacytidine (5-Aza) was added into the cell culture of the experimental group on the third day. The expression of troponin I in MSCs was assayed by immunohistochemistry on the 28th day. AdTrackCMV- hVEGF165 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into the MSCs, and subsequent VEGF expression was detected by Northern blotting and Western blotting while enzyme-linked immunosorbent assay (ILISA) was employed to examine the VEGF concentration in the supernatant of the culture medium. RESULTS: Following successful isolation and culture of the MSCs from rabbit bone marrow, 5-Aza-induced differentiation of the cells into myogenic cells was demonstrated by their positive staining for cardiac troponin I (cTnI). Northern blotting showed that the expression of VEGF 165 mRNA was much higher in the VEGF165 gene-transfected cells than in the control cells. Western blotting showed VEGF expression in the transfected cells. The concentration of VEGF in the supernatant mounted to the peak level 3-5 d after VEGF165 gene transfection (1,011-1,027 pg/ml) and decreased gradually thereafter, but still maintaining higher levels than those in the control group and pAdTrackCMV group (349 pg/ml vs 116 pg/ml and 125pg/ml, respectively, P<0.01). CONCLUSION: MSCs can be induced to differentiate into myogenic cells in vitro and express VEGF after VEGF gene transfection, and this success may provided a basis for combining MSC transplantation with gene therapy for regeneration of the damaged myocardial cells.     

CO-TRANSFECTION OF RAT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS WITH HUMAN BMP2 AND VEGF165 GENES

Objective To explore the feasibility and efficacy of lentivirus-mediated co-transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene and human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene. Methods The hVEGF165 and hBMP2 cDNAs were obtained from human osteosarcoma cell line MG63 and cloned into lentiviral expression vectors designed to co-express the copepod green fluorescent protein (copGFP). The expression lentivector and packaging Plasmid Mix were co-transferred to 293TN cells, which produced the lentivirus carrying hVEGF165 (Lv-VEGF) or hBMP2 (Lv-BMP), respectively. MSCs of Wistar rats were co-transfected with Lv-BMP and Lv-VEGF (BMP+VEGF group), or each alone (BMP group and VEGF group), or with no virus (Control group). The mRNA and protein expressions of hVEGF165 and hBMP2 genes in each group were detected by real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral expression vectors carrying hVEGF165 or hBMP2 were correctly constructed and confirmed by restriction endonucleses analysis and DNA sequencing analysis. A transfer efficiency up to 90% was archieved in all the transfected groups detected by the fraction of fluorescent cells using fluorescent microscopy. From the results generated by real-time PCR and ELISA, VEGF165 and BMP2 genes were co-expressed in BMP+VEGF group. No significant difference of BMP2 expression was detected between BMP+VEGF and BMP groups (P>0.05). Similarly, there was no significant difference of VEGF165 expression between BMP+VEGF and VEGF groups (P>0.05). Conclusion VEGF165 and BMP2 genes were successfully co-expressed in MSCs by lentivirus-mediated co-transfection, which provided a further foundation for the combined gene therapy of bone regeneration.     

人VEGF 165基因转染大鼠内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组。ELISA检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响。结果FITC-UEA-Ⅰ和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且可促进EPCs的增殖,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子(VECF)基因修饰的免骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法 制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VFGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VECF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），测定其生长曲线和表面标志CD34，CD44，CD45及SH3，检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后；用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs，观察转染后细胞形态和生长状况，通过RT-PCR，Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性，CD45和CD34阴性，可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞；经RT-PCR，Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs，并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

血管内皮细胞生长因子体外修饰骨髓基质干细胞关节镜下回植治疗兔股骨头坏死的研究

目的 检测rAAV-2-hVEGF-165转染骨髓基质干细胞后的基因表达,研究髓芯减压关节镜监视下hVEGF基因转染骨髓基质干细胞在治疗股骨头缺血性坏死中的作用及价值.方法 制备rAAV-2-hVEGF-165,将病毒以感染被率(MOI)为1×10~5v.g./cell转染兔骨髓基质干细胞,应用腺相关病毒介导绿荧光蛋白转染兔骨髓基质干细胞检测转染情况.应用RT-PCR和免疫印迹检测转染BMSCs外源hVEGF基因的转录与表达,得出最佳的转染时间.关节镜监视并对坏死骨清除后植入骨髓基质干细胞,术后2、4、8周分别对各组兔股骨头行X线分析,生物力学分析,切片血管计数并行免疫组化检查,观察疗效.结果 rAAV-2-hVEGF-165转染的兔骨髓基质干细胞可有效表达hVEGF-165,RT-PCR和免疫印迹检测可见转染MSCs中外源hVEGF基因的转录与表达.转染后48 h即可有表达,10 d时表达最强.免疫组化检测发现植入转染的骨髓基质干细胞2周后出现阳性表达,8周后强阳性表达.生物力学分析显示植入转染细胞组股骨头强度接近正常股骨头.结论 hVEGF-165基因转染的兔骨髓基质干细胞可有效表达具有生物活性的hVEGF-165蛋白.通过关节镜监视可以彻底清除死骨,使hVEGF-165基因修饰的骨髓基质干细胞准确的回植入股骨头坏死处,可使股骨头缺血性坏死的修复加强.回植入兔股骨头的hVEGF-165基因可有效表达.     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。