嗜黏蛋白阿克曼菌对大鼠胰岛细胞瘤细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌功能的影响

  目的  探讨嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila, A. muciniphila）对大鼠胰岛细胞瘤细胞（INS-1）增殖、凋亡及胰岛素分泌功能的影响。  方法  将INS-1细胞分为正常组、修复组和保护组,每组均用3种A. muciniphila干预物（活菌、灭活菌和分泌物）处理48 h,并设不干预的空白对照。正常组INS-1细胞直接干预;修复组INS-1细胞先用链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）造模再加干预物;保护组INS-1细胞先用干预物作用再加STZ造模。干预结束,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测细胞增殖;使用葡萄糖刺激,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测胰岛素分泌水平;实时荧光定量PCR技术检测胰岛素分泌相关基因和凋亡基因表达,Western blot检测Bax凋亡蛋白的表达。  结果  A. muciniphila干预物对INS-1细胞作用48 h后,其细胞形态无明显变化。A. muciniphila活菌干预的修复组INS-1细胞增殖活性较空白对照降低（P<0.005）。A. muciniphila干预物对正常组、修复组和保护组INS-1细胞的胰岛素分泌没有影响（P>0.05）。A. muciniphila分泌物可促进正常组、修复组和保护组INS-1细胞葡萄糖转运蛋白2基因(glucose transporter 2, Glut2)和修复组葡萄糖激酶基因 (glucokinase, GCK)的表达（P<0.05）。3种A. muciniphila干预物处理后的正常组INS-1细胞Bcl₂-associated X基因 (Bax)的表达量减少（P<0.001）,A. muciniphila死菌干预的修复组INS-1细胞Bax基因表达量减少（P<0.05）。A. muciniphila干预物处理的细胞Bax蛋白表达减少。  结论  A. muciniphila可促进INS-1细胞胰岛素分泌相关基因的表达,抑制凋亡基因和凋亡蛋白Bax的表达,为研究如何用A. muciniphila改善2型糖尿病提供了新的方向。     

糖毒性下UCP2介导的胰岛功能紊乱的研究

目的 研究不同浓度高糖对胰岛INS-1细胞解偶联蛋白2(UCP2)基因表达的影响,探讨UCP2基因与高糖刺激下氧化应激和胰岛素分泌之间的关系,进一步了解糖尿病糖毒性的发病机制.方法 将不同浓度的葡萄糖作用于INS-1细胞,镜下观察INS-1细胞的形态改变,应用可见分光光度计测定丙二醛(MDA)含量,运用ELISA方法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS),同时应用RT-PCR方法检测UCP2基因的表达.结果 ①随着糖浓度的增加,INS-1细胞的凋亡增多,MDA含量逐渐增加,GSIS值逐渐下降,不同糖浓度组比较,差异具有显著性意义(P<0.01).②随着葡萄糖浓度增加,INS-1细胞UCP2 mRNA的表达总体逐渐增强.结论 高糖可促进INS-1细胞凋亡,在高糖作用下活性氧物质(ROS)代谢产物MDA增多,通过激活UCP2的途径引起胰岛细胞胰岛素分泌功能受损.这可能也是糖毒性对胰岛β细胞损害的一个重要环节.     

Mibefradil抑制高糖诱导的胰岛素分泌作用及其机制的初步研究

目的 初步探讨Mibefradil对高糖作用下胰岛细胞胰岛素分泌的作用及其机制.方法 体外培养大鼠胰岛瘤β细胞株(INS-1),将INS-1细胞分为对照组(11.1 mmol/L葡萄糖)、高糖组(33.3 mmol/L葡萄糖)、药物组(11.1 mmol/L葡萄糖+1μmol/L Mibefradil、1μmol/L NNC 55-0396、10 μmol/L尼卡地平)、高糖+药物组(33.3 mmol/L葡萄糖+1μmol/L Mibefradil、1μmol/L NNC 55-0396、10 μmol/L尼卡地平),先用不同浓度葡萄糖孵育细胞48 h,再按分组加入药物继续孵育24 h.采用放射免疫法检测细胞培养上清胰岛素含量,RT-PCR及Western blot检测T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达.结果 与对照组相比,高糖组能够明显增加细胞胰岛素分泌(P＜0.05)和胰岛细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2基因及蛋白表达(P＜0.05),而药物组胰岛细胞胰岛素分泌水平和T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达则与对照组无显著差异(P＞0.05);与高糖组相比,高糖+药物组可不同程度降低INS-1细胞胰岛素分泌,其中Mibefradil组显著降低胰岛素分泌(P＜0.05)和T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达(P＜0.05).结论 Mibefradil可能通过下调胰岛细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达抑制高糖作用下INS-1细胞胰岛素分泌.     

转化生长因子-β对大鼠胰岛素基因表达的调节作用

目的：研究不同浓度转化生长因子-β（TGF-β）对大鼠胰岛细胞胰岛素基因表达的影响,探讨TGF-β在2型糖尿病治疗中的作用。方法：大鼠胰岛细胞与不同刺激浓度的TGF-β（0ng／mL、1ng／mL、2ng／mL、5ng／／mL、10ng／mL、20ng／mL）和葡萄糖浓度分别为2．2mmol／L、5．5mmol／L、11．1mmol／L的RPMI1640营养液共培养24h后,提取细胞总RNA.运用RT-PCR技术检测胰岛素基因表达的变化。结果：葡萄糖浓度为2．2mmol／L时,随TGF-β浓度逐渐升高,胰岛素基因表达量无明显变化;葡萄糖浓度为5．5mmol／L时,TGF-β浓度由0ng／mL升至2ng／mL时,胰岛素基因表达量无变化,而当TGF-β浓度进一步升高,胰岛素基因表达量呈剂量依赖性升高;葡萄糖浓度为11．1mmol／L时,随TGF-β浓度升高,胰岛素基因表达量呈浓度依赖性升高。结论：TGF-β以葡萄糖依赖和浓度依赖方式促进胰岛素基因的表达：     

磷脂酶Cβ1过表达对葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响

目的 观察过表达磷脂酶Cβ1(phospholipaae C β1,PLCβ1)对葡萄糖刺激胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)的影响.方法 ①设定葡萄糖浓度梯度:10、20、40、80、100 mmol/L,分别刺激INS-1细胞40 min,检测细胞培养上清液中胰岛素含量,确定最适的葡萄糖刺激浓度;设定时间梯度:20、40、60、80、120 min,以最适葡萄糖浓度刺激,检测胰岛素含量,确定最适的刺激时间.②以最适葡萄糖浓度刺激INS-1细胞适当时间后,RT-PCR检测PLCβ1表达变化.③构建PLCβ1真核表达载体(PCMV-HA-PLCβ1),转染INS-1细胞,Western blot检测INS-1细胞中PLCβ1蛋白的表达.④收集转染后INS-1细胞培养上清液,检测胰岛素含量.结果 用40 mmol/L葡萄糖刺激60 min,INS-1细胞的胰岛素分泌量最大;RT-PCR观察刺激后PLCβ1表达显著升高;过表达PLCβ1的INS-1细胞培养上清液中胰岛素含量为(1.906±0.080)ng/ml,较转染PCMV-HA载体的对照组(0.740±0.091)ng/ml显著升高(P<0.01).结论 过表达PLCβ1显著增加INS-1细胞的胰岛素分泌,提示PLCβ1可能参与GSIS信息传递.     

游离脂肪酸对大鼠胰岛分泌功能和胰岛细胞凋亡的影响研究

目的：研究游离脂肪酸对体外培养SD大鼠胰岛功能和胰岛细胞凋亡的影响并探讨可能机制。方法：取健康雄性SD大鼠胰岛原代分离培养,分为6组,培养1d：NC1组（5．6mmol／L葡萄糖）、FFA1组（0．25mmol／L）、FFA2组（0．5mmol／L）;培养3d：NC2组（5．6mmol／L葡萄糖）、FFA3组（0．25mmol／L）、FFA4组（0．5mmol／L）;每组6个样本,每个样本20个胰岛。采用RT—PCR扩增胰岛素、PDX-1、Bax、Caspase-3基因mRNA表达,TUNEL法检测胰岛细胞凋亡率,放射免疫法检测胰岛素水平。结果：①FFA1、FFA2组Insulin、PDX-1基因表达量、胰岛素分泌较NC1组明显下降,FFA1、FFA2组凋亡基因Bax、Caspase-3表达量及胰岛细胞凋亡率较NC1组明显升高,差异有统计学意义（P〈0．05）;②FFA3、FFA4组Insulin、PDX-1基因表达量、胰岛素分泌较NC2组明显下降,FFA3、FFA4组凋亡基因Bax、Caspase-3表达量及胰岛细胞凋亡率较NC2组明显升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：游离脂肪酸抑制体外培养SD大鼠胰岛细胞的胰岛素分泌功能,其可能机制是FFA抑制胰岛素基因、PDX-1基因的合成,刺激胰岛细胞凋亡基因Bax、Caspase-3表达,并导致胰岛细胞凋亡,最终导致胰岛细胞分泌功能下降。     

大鼠胰岛α细胞及其分泌物对β细胞功能的影响

目的：探讨大鼠胰岛α细胞和胰高血糖素样肽1（GLP-1）对β细胞（INS-1细胞,即胰岛素瘤细胞）功能的影响,阐明α细胞与INS-1细胞混合移植对降糖效果影响的可能机制。方法：采用MTT法分析10%、20%和30%胰岛α细胞条件培养基和0.03、0.30、3.00和30.0 mg·L^-1 GLP-1作用下INS-1细胞的增殖能力;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测10%、20%和30%胰岛α细胞、胰岛α细胞条件培养基和不同浓度GLP-1作用下INS-1细胞胰岛素释放水平;采用激光共聚焦显微镜分析高糖和GLP-1作用下INS-1细胞内Ca²⁺浓度;采用Western blotting法分析不同浓度的胰岛α细胞条件培养基和不同浓度GLP-1作用下胰岛素蛋白表达水平;将INS-1细胞、INS-1细胞与α细胞的混合物移植至糖尿病裸鼠左肾包膜下,监测血糖,观察肾脏形态,采用免疫组织化学法检测移植部位细胞中胰岛素和胰高血糖素水平。结果：与对照组比较,胰岛α细胞条件培养基和GLP-1均可促进INS-1细胞增殖和胰岛素释放（P < 0.05）。激光共聚焦显微镜分析,GLP-1可刺激INS-1细胞内Ca²⁺浓度升高（P < 0.05）。Western blotting法检测,与对照组比较,胰岛α细胞条件培养基和GLP-1作用下INS-1细胞中胰岛素蛋白表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。与移植前比较,糖尿病裸鼠肾包膜下移植INS-1细胞35d时血糖明显下降（P < 0.05）,甚至出现低血糖,移植部位明显肿胀;移植INS-1和α细胞混合物的糖尿病裸鼠血糖无明显变化（P > 0.05）,移植部位未见明显肿胀。免疫组织化学染色,移植INS-1细胞部位的组织既表达胰岛素又表达胰高血糖素。结论：胰岛α细胞及其分泌物可促进INS-1细胞增殖和胰岛素释放,但α细胞与INS-1细胞混合移植给糖尿病裸鼠可降低INS-1细胞移植的降糖效果,其机制可能与INS-1细胞既表达胰岛素基因又表达胰高血糖素基因有关。     

S-雌马酚改善高糖培养条件下INS-1细胞胰岛素分泌功能的研究

目的 研究大豆甙元活性代谢产物S-雌马酚(S-equol,S-Eq)对高糖培养条件下大鼠胰岛素瘤(INS-1)细胞胰岛素分泌功能的影响.方法 采用26.2 mmol/L葡萄糖(高糖组,H)及葡萄糖分别与不同浓度S-Eq(0.1、1、10、100 μmol/L S-Eq+H组)干预INS-1细胞24 h,另设未干预的INS-1细胞为对照组(C).采用CCK-8检测细胞活力,ELISA法测定葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)功能,TUNEL法联合Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡,Real-time PCR和Western blot分别检测前胰岛素原(preproinsulin,PPI)、葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2,Glut2)、线粒体阴离子载体解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2) mRNA及蛋白表达.结果 S-Eq能显著增加高糖培养条件下INS-1细胞活力(P＜0.05),其中1μmol/L S-Eq效果最为明显.GSIS检测发现,与对照组比较,高糖处理后INS-1细胞胰岛素分泌显著降低,而S-Eq能显著增加高糖处理的INS-1细胞的胰岛素分泌(P＜0.05).同时,0.1、1、10 μmol/L S-Eq均能明显减少高糖培养条件下INS-1细胞凋亡,上调PPI mRNA、Glut2 mRNA和Glut2蛋白表达,而显著抑制UCP2 mRNA及其蛋白的表达(P＜0.05).结论 S-Eq可有效改善高糖培养条件下INS-1细胞胰岛素分泌功能,可能与抑制细胞凋亡,调节Glut2和UCP2表达有关.     

轻度增高的游离脂肪酸与脂多糖协同抑制中性神经酰胺酶诱导INS⁃1细胞凋亡及胰岛素分泌异常的机制

目的：探讨轻度增高的游离脂肪酸与脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）协同对大鼠胰岛β细胞株INS?1凋亡及胰岛素分泌的影响及机制。方法：采用0.125 mmol/L棕榈酸和不同浓度的LPS（1、10、50 ng/mL）单独、联合作用INS?1细胞24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测Cleaved caspase?3表达;棕榈酸和LPS（50 ng/mL）单独或联合刺激INS?1细胞24 h后,HPLC法检测中性神经酰胺酶（neutral ceramidase,NCDase）活性,ELISA法检测胰岛素分泌功能;并观察转染pEGFP?C3?NCDase重组质粒后,棕榈酸和LPS刺激的INS?1细胞凋亡率及胰岛素分泌功能的改变。结果：与对照组相比,棕榈酸或LPS（50 ng/mL）单独处理,对INS?1细胞凋亡及胰岛素分泌无明显影响,但两者联合可明显增加凋亡率及Cleaved caspase?3表达（P < 0.05）。棕榈酸联合LPS作用24 h后明显抑制基础胰岛素分泌（P < 0.01）,对细胞内胰岛素含量及葡萄糖刺激的胰岛素分泌无影响。此外,棕榈酸或LPS单独刺激不影响INS?1细胞NCDase,两者联合则显著抑制其活性（P < 0.01）;而高表达NCDase能明显缓解棕榈酸联合LPS诱导的凋亡和基础胰岛素分泌减少（P < 0.05）。结论：轻度增高的游离脂肪酸联合LPS可通过抑制鞘脂信号分子代谢的关键酶——NCDase活性,促进胰岛β细胞凋亡并抑制基础胰岛素分泌。     

甲状旁腺素相关肽对INS-1细胞株胰岛素分泌的影响

目的 探讨甲状旁腺素相关肽(PTHrP)对大鼠胰岛β细胞瘤株INS-1胰岛素含量的影响.方法 根据不同干预条件分为空白对照组、PTHrP干预组(分别应用1、10、100 pmol/L的 PTHrP 干预),48 h后应用放射免疫法检测各组葡萄糖刺激胰岛素分泌作用,Fura-3/AM荧光负荷技术测定Ca2+.Western Blot检测细胞胰岛素及胰腺-十二指肠同源框1(PDX-1)的表达.结果 PTHrP对INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力及Ca2+负荷呈浓度依赖性关系.PTHrP组上调胰岛素及PDX-1表达,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 PTHrP可以促进胰岛β细胞胰岛素分泌及合成.     

葡萄糖浓度波动对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

目的初探葡萄糖浓度波动对大鼠胰岛素瘤INS-1细胞胰岛素分泌功能影响机制。方法将INS-1细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L葡萄糖培养液培养）、持续高糖组（16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养）、波动组（用16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养2 h,再换5.5 mmol/L培养3 h,每天重复3次,夜间9 h维持在5.5 mmol/L的培养液中）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）＋正常糖组、NAC＋持续高糖组、NAC＋波动组,后3组的培养基中均预先负载终浓度为1.0 mmol/L的NAC,余干预措施相同,均干预72 h。荧光素酶方法检测细胞内三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate,ATP）含量,放射免疫分析法测定胰岛素分泌水平。结果 INS-1细胞ATP含量及胰岛素分泌水平在持续高糖组及波动组均较正常糖组显著下降,且波动组下降更明显,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。NAC＋波动组及NAC＋持续高糖组细胞ATP含量及胰岛素分泌水平分别较波动组及持续高糖组显著增加,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论持续性高糖及波动性高糖损伤INS-1细胞的胰岛素分泌可能与减少细胞ATP含量有关,且波动性高糖较前者更严重,氧化应激可能是波动性高糖及持续性高糖导致INS-1细胞ATP减少的机制。     

高糖诱导氧化应激对胰岛细胞功能的影响

目的:研究不同浓度葡萄糖对INS-1细胞及胰岛分泌功能的影响,并探讨氧化应激在葡萄糖对INS-1细胞功能损伤中的作用。方法:将不同浓度葡萄糖(11.1、16.7、22.2、33.3mmol/L)作用于INS-1细胞,镜下观察INS-1细胞的形态改变,应用可见分光光度计测定丙二醛(MDA)含量,运用ELISA方法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。结果:随着葡萄糖浓度的增加,INS-1细胞的凋亡增多,MDA含量逐渐增加,GSIS值逐渐下降,不同浓度葡萄糖组间MDA含量、GSIS值差异有统计学意义(P均<0.01)。结论:高糖可促进INS-1细胞凋亡,在高糖作用下活性氧物质(ROS)代谢产物MDA增多,胰岛细胞胰岛素分泌功能受损。     

Liraglutide prevents high glucose level induced insulinoma cells apoptosis by targeting autophagy

Background  The pathophysiology of type 2 diabetes is progressive pancreatic beta cell failure with consequential reduced insulin secretion. Glucotoxicity results in the reduction of beta cell mass in type 2 diabetes by inducing apoptosis. Autophagy is essential for the maintenance of normal islet architecture and plays a crucial role in maintaining the intracellular insulin content by accelerating the insulin degradation rate in beta cells. Recently more attention has been paid to the effect of autophagy in type 2 diabetes. The regulatory pathway of autophagy in controlling pancreatic beta cells is still not clear. The aim of our study was to evaluate whether liraglutide can inhibit apoptosis and modulate autophagy in vitro in insulinoma cells (INS-1 cells).

Methods  INS-1 cells were incubated for 24 hours in the presence or absence of high levels of glucose, liraglutide (a long-acting human glucagon-like peptide-1 analogue), or 3-methyadenine (3-MA). Cell viability was measured using the Cell Counting Kit-8 (CCK8) viability assay. Autophagy of INS-1 cells was tested by monodansylcadaverine (MDC) staining, an autophagy fluorescent compound used for the labeling of autophagic vacuoles, and by Western blotting of microtubule-associated protein I light chain 3 (LC3), a biochemical markers of autophagic initiation.

Results  The viability of INS-1 cells was reduced after treatment with high levels of glucose. The viability of INS-1 cells was reduced and apoptosis was increased when autophagy was inhibited. The viability of INS-1 cells was significantly increased by adding liraglutide to supplement high glucose level medium compared with the cells treated with high glucose levels alone. 

Conclusions  Apoptosis and autophagy were increased in rat INS-1 cells when treated with high level of glucose, and the viability of INS-1 cells was significantly reduced by inhibiting autophagy. Liraglutide protected INS-1 cells from high glucose level-induced apoptosis that is accompanied by a significant increase of autophagy, suggesting that liraglutide plays a role in beta cell apoptosis by targeting autophagy. Thus, autophagy may be a new target for the prevention or treatment of diabetes.

     

硫氧环蛋白相互作用蛋白与糖尿病关系的研究

目的 研究高糖环境下INS-1细胞中硫氧环蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)的表达对胰岛素分泌的影响以及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、艾塞那肽(Exenatide,Ex-4)的保护作用.方法 以含11.1 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培养液培养INS-1细胞,当细胞生长至80%融合时,分别转入含有4.0 mmol/L葡萄糖(NG组)、16.7 mmol/L葡萄糖(HG组)及16.7 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L NAC(HG+N组)、16.7 mmol/L葡萄糖+100 nmol/L Ex-4(HG+E组)的RPMI 1640培养液中继续培养48 h;采用real-time PCR法检测TXNIP、胰岛素基因及胰岛素转录因子MafA的mRNA水平.结果 HG组与NG组比较,TXNIP mRNA的表达明显上升,胰岛素mRNA、MafA mRNA的表达均明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.01).HG+N组、HG+E组与HG组比较,TXNIP mRNA的表达均明显下降,胰岛素mRNA、MafA mRNA的表达均明显提高,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论 高浓度葡萄糖可通过介导TXNIP的过度表达而导致胰岛素基因及MafA表达下降;特异性地抑制高糖下TXNIP的过度表达可以恢复胰岛素基因及MafA的表达.     

免疫抑制剂依维莫司对大鼠胰岛细胞的毒性作用

目的 观察依维莫司等免疫抑制剂对大鼠胰岛瘤细胞(INS-1)和SD大鼠正常胰岛细胞代谢活性和功能的影响,旨在探讨依维莫司在胰岛移植免疫抑制治疗中的安全性和可行性.方法 不同浓度梯度免疫抑制剂依维莫司、西罗莫司、环胞霉素A和霉酚酸酯处理INS-1和正常胰岛细胞,用MTT法检测细胞的代谢活性;用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测胰岛细胞的胰岛素分泌功能.结果 临床血药浓度以上的依维莫司和西罗莫司高浓度组胰岛细胞增殖抑制率低于环胞霉素A和霉酚酸酯(P＜0.05);依维莫司在临床血药浓度范围和其它免疫抑制剂一样可以抑制胰岛细胞的胰岛素分泌功能,各组间的刺激指数差异无统计学意义.结论 依维莫司和西罗莫司对INS-1细胞及SD大鼠胰岛的毒性作用较小,环胞霉素A和霉酚酸酯对INS-1和SD大鼠胰岛具有较为明显的毒性作用,依维莫司有望作为新型免疫抑制剂应用于临床胰岛移植.     

余甘子中没食子酸抑制高糖诱导胰岛β细胞凋亡

目的 探究余甘子中没食子酸对高糖诱导胰岛β细胞凋亡的保护作用, 为从中药中发现治疗糖尿病的天然化合物提供一定参考依据.方法 体内实验造模:以wistar雄性大鼠作为体内研究对象, 腹腔注射50mg/kg STZ, 造模成功后口服给予25 mg/kg的没食子酸, 阳性药选用西格列汀, 给药4周后, 取血、摘取胰腺, 进行HE染色, 采用Western blot法测定高糖状态下胰腺组织中NLRP3、TXNIP蛋白表达;体外实验造模:以胰岛瘤细胞株INS-1细胞作为体外研究对象, 建立高糖诱导细胞凋亡模型, 在无糖RPMI1640完全培养基中添加25mmol/L葡萄糖培养INS-1细胞, 以没食子酸为受试样品, 将实验分为正常对照、高糖模型、没食子酸低、中、高剂量组.采用MTT法测定细胞活性, 采用QPCR法、Western blot法测定高糖状态下INS-1细胞中NLRP3、TXNIP的m RNA表达, 检测NLRP3、TXNIP蛋白表达.结果 (1) INS-1细胞在葡萄糖浓度为25 mmol/L的培养基中培养48 h后, 与对照组比较, 凋亡率升高 (P<0.01) , 表明高糖状态下细胞凋亡模型建立成功. (2) 10、5、2.5μmol/L的GA分别处理对照组和高糖模型组细胞, 对照组细胞存活率没有明显变化 (P>0.05) .体内实验中与对照组比, 高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3、TXNIP的蛋白表达具有统计学差异 (P<0.05) ;GA处理后蛋白表达水平明显下调, 有统计学差异 (P<0.05) , 体外实验中与对照组比, 高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3的蛋白表达有统计学差异 (P<0.01) , GA处理后蛋白表达水平明显下调 (P<0.01) ;TXNIP的蛋白表达水平上调 (P<0.05) ;GA处理后蛋白表达水平明显下调 (P<0.05) ; (3) 与对照组比, 高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3、TXNIP m RNA表达水平均上调 (P<0.01) ;GA处理后蛋白表达水平明显下调 (P<0.01) .结论 将细胞置于添加25 mmol/L浓度葡萄糖的无糖RPMI1640完全培养基中培养48 h.GA对正常INS-1细胞增殖无影响, GA具有保护高糖状态下INS-1细胞凋亡的作用, 其机制可能与GA下调NLRP3、TXNIP的基因表达有关.     

高浓度葡萄糖条件下罗格列酮对NIT-1细胞FOXO1、TSC2基因表达及细胞分泌功能的影响

目的：研究罗格列酮在不同浓度葡萄糖条件下,对胰岛β细胞增殖凋亡与胰岛素分泌以及叉头转录因子-1(FOXO1)和结节性硬化症-2(TSC2)表达的影响。方法： 将 NIT-1细胞按每孔5×10个放置于24孔细胞培养板,培养48 h后随机分为各处理组：5.6、7.8、11.1、16.7、22.2 和27.6 mmol/L葡萄糖组,继续培养24 h后再分别施加1×10^-5mol/L罗格列酮,分别于干预24和48 h后取细胞培养上清液,采用放射免疫法检测胰岛素水平和免疫荧光法检测细胞增殖情况,RT-PCR半定量法检测FOXO1和TSC2 mRNA表达水平。结果：①1×10^-6～1×10^-5 mol/L罗格列酮可以分别在不同浓度葡萄糖培养条件下使胰岛NIT-1细胞增殖（P<0.05）,且这种变化趋势随剂量的增加而增加（即1×10^-5 mol/L罗格列酮组＞1×10^-6 mol/L罗格列酮组＞1×10^-7 mol/L罗格列酮组）。1×10^-5 mol/L的罗格列酮干预后,可见细胞凋亡百分率增加趋势随着葡萄糖浓度不断升高;②在同一浓度罗格列酮作用下,当葡萄糖浓度为11.1 mmol/L时,胰岛素分泌水平最高,高于其他各组（均P<0.05）,随着葡萄糖浓度增加,胰岛素分泌量逐渐下降（11.1 mmol/L葡萄糖组>16.7 mmol/L葡萄糖组>22.5 mmol/L葡萄糖组>27.6 mmol/L葡萄糖组）,而葡萄糖为5.6 mmol/L时,胰岛素分泌量最低;③ 在1×10^-5 mol/L罗格列酮干预后,FOXO1和TSC-2 mRNA的表达水平均较未干预组明显下降,且呈现出5.6 mmol/L组＜11.1 mmol/L组＜16.7 mmol/L组＜22.5 mmol/L组＜27.6 mmol/L组的变化趋势,而且葡萄糖浓度＞16.7 mmol/L的各组均较前面小剂量葡萄糖组（≤11.1 mmol/L各组）表达明显。结论：罗格列酮可以通过直接影响胰岛β细胞内FOXO1和TSC2表达促进胰岛β细胞的增殖及影响细胞胰岛素分泌功能,提示通过调控FOXO1和TSC2表达,可以直接影响胰岛β细胞的生物学功能,如分泌功能、细胞的增殖与凋亡以及改善胰岛素抵抗状况。