重组人肝细胞生长因子基因的克隆

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人胎盘组织内成功地扩增全长肝细胞生长因子（ＨＧＦ）ｃＤＮＡ基因（２ １８４ｂｐ）,并将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体,经限制性核酸内切酶ＮｄｅⅠ,ＢｇｌⅡ,ＨｉｎｄⅢ,ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ的酶谱分析和ＤＮＡ测序分析证实。再将其亚克隆至逆病毒载体ｐＬＮＬ－ＸＨＣ,可进一步用于基因表达和基因治疗的研究。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

葡萄糖苷酶Ⅰ特异性siRNA-EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建葡萄糖苷酶Ⅰ(glucosidaseⅠ, GluⅠ)特异性siRNA真核表达载体。方法:根据 siRNA靶序列选取原则,设计并合成针对鼠葡萄糖苷酶ⅠcDNA的寡聚DNA,退火并连接至载体 pSilencer1.0 U6,再将 U6 启动子及下游插入片断一起切下,克隆至真核表达载体 pEGFP C1,通过限制性酶切和测序对重组表达载体进行鉴定,最后将该质粒转染至HeLa细胞,共聚焦荧光显微镜观察其表达。结果:①限制性酶切和测序结果表明成功构建了带有EGFP基因的鼠GluⅠ特异性的siRNA真核表达载体 pC 1U6glu; ②共聚焦荧光显微镜观察结果表明p C1U6glu成功转染至HeLa细胞。结论:pC 1U6glu的成功构建及表达为进一步利用 siRNA研究葡萄糖苷酶Ⅰ的功能和治疗肿瘤奠定基础。     

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究

目的 构建钙网织蛋白/黑素瘤抗原基因-A3(CRT/MAGE-A3)双基因重组腺病毒载体,并进行体外表达研究.方法 从表达质粒pcDNA3/CRT中切取目的片段CRT,定向克隆至穿梭载体pShuttle-GFP-CMV.根据Genbank中提供的黑素瘤基因序列,设计并合成引物,以人肺癌组织cDNA文库为模板采用RT-PCR技术扩增人黑素瘤抗原基因-A3基因片段,测序后将黑素瘤抗原基因-A3基因片段定向克隆至穿梭载体,进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi.结果 目的 片段CRT转入穿梭载体后,酶切鉴定pShuttle-(△GFP)-CRT正确.人肺癌组织经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,测序证实为MAGE-A3 DNA后,克隆至穿梭载体pShutde-(△GFP)-CRT构建穿梭载体pShuttle-CRT-MAGE-A3,酶切鉴定证实构建正确.酶切穿梭载体将双基因片段克隆至腺病毒载体pAdxsi得到Ad-CRT/MAGE-A3病毒载体,酶切鉴定证实构建成功.转染293LP细胞并用Western blot检测到其体外表达.结论 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体并证实其能在体外有效表达CRT蛋白及MAGE-A3蛋白.     

1pcDNA3.1-Ercc6l真核表达载体的构建及在P19细胞内的表达

目的构建Ercc6l的正、反义真核表达载体,并在P19胚胎癌细胞内瞬时表达,在细胞学水平对基因功能进行初步研究。方法KpnⅠ/XhoⅠ双酶切pGEM-T-Ercc6l获得目的基因Ercc6l,将其克隆到同样经过双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)Myc His6,重组质粒pcDNA3.1(+/-)-Ercc6l经菌落PCR和双酶切鉴定;脂质体介导法体外瞬时转染正义载体至P19细胞,RT-PCR检测基因在细胞内的表达活性情况。结果重组质粒经菌落PCR和KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定,表明真核表达载体构建正确;脂质体介导法瞬时转染正义载体至P19细胞后,检测表明转染细胞能够表达Ercc6l。结论成功构建了Ercc6l正、反义真核表达载体,其正义载体转染真核细胞后能在其中表达。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白基因 真核共表达质粒的构建

 【目的】 构建含有人巨细胞病毒(CMV)调控表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP。【方法】 设计HSV-tk cDNA的特异引物,PCR扩增获得HSV-tk基因序列, 将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒pMD18T-TK,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒,将HSV-tk基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含EGFP和HSV-tk基因的重组质粒,Lipofectin介导转染小鼠黑色素瘤B16细胞并检测其表达情况。【结果】 酶切见特异酶切图谱, 该质粒在瞬时表达时获得EGFP的良好表达。【结论】 含HSV-tk和EGFP基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP构建成功,为利用绿色荧光蛋白标记在后续实验中进行自杀性基因治疗的深入研究奠定了基础。     

携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack- PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增。检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度。结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因。构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液。结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体。     

家兔C型利钠肽基因真核表达载体的构建及鉴定

目的为开展C型利钠肽(CNP)基因治疗构建家兔CNP基因真核表达载体。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆CNP基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD 18-T中,用PstⅠ单酶切筛选出负向插入片段,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中,然后用双酶切、DNA序列测定鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果酶切及测序鉴定证实,家兔CNP基因全长编码区被准确插入到pEGFP-N1酶切位点HindⅢ和KpnⅠ中。结论含家兔CNP基因真核表达载体的成功构建和鉴定为CNP基因治疗的研究奠定了基础。     

果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体cDNA克隆及其载体的构建

目的克隆果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体(FGFR-1)全长基因序列,构建其真核表达载体pdFR1。方法采用PCR方法扩增果蝇FGFR-1基因全长序列,克隆人载体pT—Adv,转化大肠杆菌XL1-Blue,挑选白色菌落行酶切鉴定及测序。重组质粒pT—Adv／FGFR-1酶切,回收目的基因片段,将其克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中,命名为pdFR1,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pT-Adv／FGFR-1测序结果与GenBank完全一致,pdFR1行限制性内切酶酶切,酶切片段与预期值相符。结论克隆了果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体全长基因序列,构建了其真核表达载体pdFR1,为完善异种分子疫苗免疫理论莫定基础。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

人肝细胞生长因子真核表达载体的构建及在COS7细胞中的表达

目的:构建人肝细胞生长因子（HGF）的真核表达载体,并在COS₇细胞中进表达。方法:利用PCR技术扩增HGF基因,与PCI-Neo载体连接,构建成重组真核表达载体PCI-neo-HGF,应用限制性内切酶法及测序方法进行鉴定。利用脂质体将PCI-HGF转入COS₇细胞系中,用ELISA法检测培养液上清中的HGF的表达水平。结果:重组真核表达载体PCI-neo-HGF经限制性内切酶分析,片段与理论值相符,测序结果与GenBank 对比, HGFcDNA序列同源性99%, 插入正确;将重组真核表达载体PCI-neo-HGF转染COS₇细胞,于转染12 h开始有表达,36～72 h表达量较高(约2 000 ng•L^-1),以后逐渐下降。结论: 成功构建了带有HGF 基因真核表达载体,并能在转染细胞中表达。     

四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建四环素诱导性人肝细胞生长因子（HGF）真核表达载体。方法 运用基因重组技术，将人HGF cDNA全长序列，定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluⅠ和SalⅠ之间，限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果 重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切，与理论值相符；测序结果与GenBank比对，序列正确。结论 本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF，为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略。     

构建人血管内皮生长因子cDNA逆转录病毒表达质粒

目的 :构建人血管内皮生长因子 ( VEGF) c DNA逆转录病毒表达质粒。方法 :采用 PCR方法从 pc DNA- VEGF165质粒中扩增 VEGF165基因 ,在序列两端分别引入 Eco R 和 Bam H 限制性内切酶识别位点 ,并克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中。结果 :酶切鉴定、PCR扩增以及DNA序列分析表明已经将 VEGF165基因全长序列克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中 ,获得了 p LXSN- VEGF165重组质粒。结论 :成功地构建了人 VEGF c DNA逆转录病毒表达质粒 ,为进一步临床应用 VEGF c DNA转基因治疗奠定了基础     

人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建

目的：克隆人转化生长因子-β1（TGF-β1）基因编码区cDNA序列，构建并鉴定TGF-β1真核表达载体。方法：设计含有EcoRI和Xhol Ⅰ酶切位点的TGF-β1 cDNA引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法，以人白细胞mRNA为模版，扩增TGF-β1基因，纯化PCR产物，TA克隆，双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，酶切鉴定阳性董组子，并进行序列测定。结果：琼脂糖凝胶电泳显示，用双酶切后形成分子量1．2kb的条带，符合物理图谱，表明表达载体构建成功，序列测定结果与预测结果完全一致。结论：成功克隆了TGF-β1基因，并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.     

Construction of hepatocyte growth factor gene recombinant adenovirus vector and its expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells

ObjectiveTo construct the adenoviral expression vector system containing human hepatocyte growth factor (hHGF) cDNA, and to further study the transduction efficiency and the expression of HGF in mesenchymal stem cells (MSCs). MethodsThe HGF cDNA was amplificated from the expression plasmid pCMV-HGF, and was subcloned into the adenovirus shuttle plasmid pDC316-IRES-EGFP vector containing a green fluorescence protein (GFP) reporter gene. Virus Ad-HGF was produced by homologous recombination in HEK293 package cells. Bone marrow derived MSCs were harvested and cultured, and then were transduced with Ad-HGF. The efficiency of Ad-HGF transduction was assessed by FACS analysis using GFP gene expression. And HGF/MSCs were generated. The HGF concentrations in supernatants of HGF/MSCs were determined by ELISA using anti-human HGF monoclonal antibody. Results The recombinant, named pDC316-HGF-IRES-eGFP, was digested with restriction enzyme, and the DNA sequencing of HGF was identical to the report in Genebank and did not reveal any mutation. GFP expression could be observed on the second day after packing of the linearized pAd-HGF in HEK293 cells and 7.15×1010pfu/ml titer of Ad-HGF was obtained. Forty-eight hours after transduction, 96.89% of HGF/MSCs were GFP positive. Peak concentration levels of hHGF(103ng/mL) in the cultured supernatants were detected on day 2 post-transduction, and the adenovirus-mediated expression of HGF by MSCs was maintained for at least 2 weeks in vivo. ConclusionOur data demonstrated that the adenovirus expression'vector system pDC316-HGF-IRES-EGFP has been constructed successfully, and their effective expressions also have been obtained in MSCs. This will provide material basis for the next study on liver regeneration after small-for-size liver transplantation.     

人α1微球蛋白/bikunin前体cDNA的克隆与鉴定

目的:从人胚胎肝、肾和胰腺组织RNA中钓取α1微球蛋白/bikunin前体(AMBP)cDNA序列,构建其重组克隆载体。方法:采用Trizol法提取人胚胎肝、肾和胰腺组织RNA,以此为模板,应用RT-PCR技术扩增目的基因,构建重组载体pMD18-T-ambp。采用蓝白筛选,经限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。结果:RT-PCR显示,仅从肝组织RNA中扩增出ambp基因片段,而肾和胰腺组织中均未检测出其 mRNA的转录。构建的重组载体经SalⅠ/EcoRⅠ双酶消化得到1098bp大小的片段,与人AMBP cDNA片段大小一致。序列分析结果显示,克隆到载体中的目的基因与GenBank上登录的人AMBP cDNA序列完全一致。结论:从人胚胎肝组织RNA中成功钓取了AMBP cDNA序列,并正确构建其克隆载体pMD18-T-ambp。     

携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达

目的：构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒（Lent/EGFP）,感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平。方法：采用PCR方法克隆EGFP cDNA;将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在293ET细胞中包装出携带EGFP基因的重组慢病毒Lent/EGFP;重组病毒感染NIH 3T3细胞,FACS检测重组病毒滴度;Lent/EGFP感染体外培养的原代SD大鼠皮层神经细胞,共聚焦荧光纤维镜观察原代神经细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。结果：基因测序证明克隆的EGFP cDNA与GenBank提供的序列完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果证实EGFP正确插入pLenti6/V5TOPO;FACS检测病毒滴度为2×10⁶;在体外分离培养的原代SD大鼠皮层神经细胞中,重组病毒感染72 h后可见较强的绿色荧光蛋白表达。结论：采用改良的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组慢病毒载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达。     

小鼠pMSV-Slfn5-GFP表达质粒构建及基因结构分析

目的 构建小鼠pMSV-Slfn5-GFP基因重组表达质粒及基因结构分析.方法 提取小鼠肝脏组织中总RNA,反转录为cDNA.PCR扩增小鼠Slfn5编码序列片段,并与pGEM-T Easy载体连接,连接产物转化到大肠埃希菌DH5α中.挑取阳性克隆提取质粒,经限制性内切酶H pα工和Xho Ⅰ双酶切鉴定.酶切鉴定正确的质粒送Macrogen USA测序.测序正确的质粒通过HindⅢ和XhoⅠ与pMSV-GFP连接,并命名为pMSV-Slfn5-GFP.通过UCSC(http://genome.ucsc.Edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因组结构,并通过NCBI确定Sgn5的蛋白结构域.结果 Slfn5全长基因序列克隆到表达载体pMSV-GFP中,酶切鉴定片段大小为2.65 kb.Slfn5的AAA_4蛋白结构域由phylogeny.fr确定了该结构在Slfn蛋白家族中的保守性.结论 成功构建了小鼠pMSV-Slfn5-GFP全长基因表达载体.