大鼠Hes1腺病毒干扰载体构建及功能鉴定

目的 构建高滴度大鼠Hes1腺病毒干扰载体(Ad-Hes1-shRNA).方法 设计3对Hes1-shRNA寡核苷酸序列,通过定向克隆构建pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干扰质粒,将pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA和pHBAd-BHG共转染293T细胞,以包装Ad-Hes1-shRNA,利用改进TCID50法进行病毒滴度测定.Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞,Western blot检测Hes1表达.结果 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA构建成功,Ad-Hes1-shRNA包装顺利,滴度为1.0×1011 PFU/mL,并可在H9c2心肌细胞内发挥干扰效应.结论 Ad-Hes1-shRNA包装成功,在心肌细胞中具有Hes1的干扰效应.     

骨形态发生蛋白9、6双表达腺病毒载体的构建及其成骨诱导作用

目的构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、6重组腺病毒并探讨其对C3H10细胞成骨的影响。方法以单一表达的BMP9或BMP6 AdEasy质粒为模板,PCR自扩增BMP9和BMP6基因序列,先后将其插入穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质粒pASG2-BMP9、6,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,酶切鉴定成功后,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达腺病毒AdBMP9、6,体外转染C3H10细胞,RT-PCR方法检测BMP9、BMP6 mRNA水平的表达,早期成骨指标碱性磷酸酶染色、晚期指标钙茜素红染色检测其成骨作用。结果成功构建双表达重组腺病毒AdBMP9、6,RT-PCR证实双表达腺病毒能成功转染C3H10细胞,并且转染的C3H10细胞早晚期成骨指标碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色活性较单一表达BMP9或BMP6的腺病毒组均增强。结论双表达重组腺病毒载体AdBMP9、6具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力,且较单一表达BMP9或BMP6强。     

靶向血管内皮细胞因子受体3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建

目的构建靶向血管内皮细胞因子受体3(VEGFR-3)的小干扰RNA重组腺病毒表达载体。方法将构建的靶向VEGFR-3特异性小干扰RNA真核表达载体pGenesil-siRNA的启动子及siRNA序列克隆入穿梭质粒pAdTrack,将质粒线性化处理后转化入pAdEasy。重组腺病毒载体线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定;扩增后感染结肠癌LoVo细胞并进行Western blotting检测VEGFR-3蛋白的表达。结果双酶切鉴定及测序证实pAdTrack-pG-siRNA及pAd-VEGFR3-siRNA质粒构建正确,扩增纯化测定重组病毒pAd-VEGFR3-siRNA的滴度为5.6×109pfu/mL。病毒感染结肠癌LoVo细胞后测定VEGFR-3蛋白表达明显降低。结论靶向VEGFR-3小干扰RNA的腺病毒载体构建成功。     

核糖体蛋白S3a RNA干扰重组慢病毒载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的 构建表达小鼠核糖体蛋白S3a 特异性RNA干扰重组慢病毒载体(Lenti-shmRPS3a),分析其对细胞凋亡的影响。方法 设计针对小鼠RPS3a mRNA 4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统 pLLU2G-eGFP中构建重组质粒,将重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞组装病毒,检测病毒滴度。病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR和Western blot检测干扰效果,流式细胞术分析其对凋亡的影响。结果 PCR和测序证明成功构建出Lenti-shmRPS3a慢病毒载体,病毒滴度为6-9×10₇TU/ml;RT-PCR表明Lenti-shmRPS3a的沉默效率高达72.64%、Western Blot证明RPS3a蛋白水平表达降低;流式细胞术证明感染了Lenti-shmRPS3a慢病毒载体的细胞凋亡率较对照组明显升高。结论 表达小鼠核糖体蛋白S3a shRNA慢病毒载体能有效沉默RPS3a基因表达,促进细胞凋亡。     

PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建靶向PIK3CA（P110α）基因的RNA干扰慢病毒载体。方法针对PIK3CA—mRNA（NM_006218）设计4个RNA干扰靶点序列和一个阴性对照靶点,构建慢病毒转移质粒pGCL—GFP。构建成功的RNA干扰质粒与PIK3CA表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western Blot检测PIK3CA蛋白表达,筛选出干扰效果最好的RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒并检测其滴度。结果4个靶点和阴性对照靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westem Blot检测获得最有效干扰靶点,并成功包装成滴度为2×10^8TU／ml的慢病毒。结论成功构建可供感染的PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体,为进一步研究PIK3CA功能和用慢病毒进行卵巢癌基因治疗奠定了基础。     

双表达骨形态发生蛋白9、7重组腺病毒载体的构建及其对间充质干细胞C3H10的成骨作用

目的 构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、7腺病毒重组体并进行初步成骨鉴定.方法 自单一表达的BMP9或BMP7 AdEasy质粒上扩增BMP9和BMP7基因序列,先后定向亚克隆至同一穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质pASG2-BMP9、7.酶切、PCR鉴定及测序正确后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组获得双表达BMP9、BMP7腺病毒质粒,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达BMP9、BMP7腺病毒,体外转染C3H10细胞,碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色检测其早晚期成骨作用.结果 成功构建双表达BMP9、BMP7的腺病毒,RT-PCR证实双表达腺病毒在C3H10细胞中表达,其转染的C3H10细胞早期碱性磷酸酶染色及晚期钙茜素红染色活性较单一表达的BMP7或BMP9腺病毒组增强.结论 成功构建双表达BMP9、BMP7的重组腺病毒载体,其重组体具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力.     

过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的腺病毒构建

目的设计特异性标记过氧化物酶体的绿色荧光蛋白，构建腺病毒载体，并感染培养的大鼠心肌细胞H9C2，检测该腺病毒载体的表达效率，通过共聚焦显微镜观察细胞过氧化物酶体的分布，同时给予细胞缺氧处理，对比细胞内过氧化物酶体的变化。方法（1）设计带有过氧化物酶体信号肽序列的绿色荧光蛋白序列。（2）PCR扩增该序列片断，并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack中；pAdTrack经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组。重组绿色荧光蛋白质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后，转染293A细胞，进行病毒包装，得到Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒。（3）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒和不带有信号肽序列的Ad-GFP腺病毒感染培养的H9C2，24h后共聚焦显微镜下观察。（4）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染H9C2细胞后，分为正常培养和1%氧浓度培养两组，24h后观察。结果重组Ad-GFP-Peroxi腺病毒载体构建成功；与Ad-GFP腺病毒相比，Ad-GFP-Peroxi腺病毒能够特异性显示大鼠心肌细胞内过氧化物酶体的分布；且缺氧刺激后H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象。结论利用同源重组的方法成功构建的过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的过表达腺病毒，对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率，共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况，且缺氧刺激导致过氧化物酶体分布聚集。     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

LRIG3基因特异性siRNA腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定针对LRIG3 基因的小干扰RNA(LRIG3-siRNA)腺病毒表达载体,为膀胱癌基因治疗的研究提供有效的实验工具.方法 设计可形成小发夹结构的LRIG3-siRNA模板cDNA 序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pSilencer-U6neo,构建LRIG3-siRNA表达质粒pSilencer-LRIG3.鉴定正确后,将pSilencer-LRIG3转染至HEK293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒pAd-LRIG3.大量扩增pAd-LRIG3,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度.pAd-LRIG3 感染人膀胱癌细胞T24,RT-PCR法检测LRIG3 mRNA的表达.结果酶切分析、测序鉴定表明pSilencer-LRIG3构建成功,PCR分析表明pAd-LRIG3含有LRIG3-siRNA 序列.pAd-LRIG3可抑制 LRIG3 mRNA的表达.结论 含有LRIG3-siRNA 的重组腺病毒构建成功,且具有抑制LRIG3基因mRNA 表达的功能.     

大鼠Hes1腺病毒表达载体构建及功能鉴定

目的 构建高滴度大鼠Hes1腺病毒过表达载体(Ad-Hes1).方法 以大鼠cDNA文库为模板,PCR法扩增Hes1,通过定向克隆构建pShuttle-CMV-Hes1穿梭质粒,再以pShuttle-CMV-Hes1为基础,构建pAdeno-Hes1病毒质粒,将pAdeno-Hes1转染293细胞,包装Ad-Hes1,利用改进TCID50法进行病毒滴度测定.Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞,Western blot检测Hes1表达.结果 pShuttle-CMV-Hes1穿梭质粒、pAdeno-Hes1病毒质粒构建成功,总滴度为1.6×1011 PFU,Ad-Hes1可在H9c2心肌细胞内正常表达,其MOI值为30.结论 Ad-Hes1包装成功,为进一步研究Hes1的心肌保护作用奠定实验基础.     

慢病毒载体介导的 shRNA 沉默非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ A 对骨髓间充质干细胞旁分泌的影响

目的：观察慢病毒介导 shRNA 沉默非肌肉球蛋白重链ⅡA（MYH9）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）旁分泌功能的影响。方法采用脂质体法将含 MYH9干扰序列的 pHBLV －U6－ZsGreen －Puro（实验组）质粒转染到293T 细胞,以转染 pHBLV －U6－ZsGreen －Puro 空载质粒的细胞为空载组,以正常未转染细胞为对照组,包装产生的病毒液感染 BMSCs。用荧光显微镜观察荧光蛋白表达;以β－actin 为内参,分别用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT －PCR）和免疫印迹（Western blot）检测 MYH9 mRNA 及蛋白表达;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测其培养基上清液中血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、促血管生成素1（ANG －1）和促血管生成素2（ANG －2）的含量。结果成功构建重组质粒 pHBLV －U6－MYH9－ZsGreen －Puro,转染293 T 细胞产生高滴度慢病毒,荧光显微镜下可见被慢病毒感染的 rBMSCs 表达强绿色荧光蛋白,qRT －PCR 和 Western blot结果显示2条慢病毒感染 MYH9 mRNA 表达水平明显下调,显著低于对照组和空载组（P ＜0．05）;沉默 MYH9基因后,实验组的 ANG －1和 bFGF 在增殖末期较对照组和空载组有明显上升（P ＜0．05）,ANG －2和 VEGF 未见明显差异（P ＞0．05）。结论pHBLV －U6－MYH9－ZsGreen －Puro 慢病毒包装质粒转染 BMSCs 后,BMSCs 旁分泌能力未受明显影响。     

ZBTB20基因干扰腺病毒的制备及功能鉴定

目的 制备靶向锌指蛋白ZBTB20基因的干扰腺病毒。方法 根据ZBTB20基因序列设计人鼠通用的干扰序列，定向克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-U6-GFP的BamHⅠ和HindⅢ位点。PmeⅠ酶切线性化的重组穿梭载体pShuttle-shZBTB20导入含有腺病毒载体pAdEasy-1的细菌，使同源重组产生重组腺病毒载体pAd-shZBTB20。用PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒载体，转染293A细胞以包装腺病毒颗粒，用TCID50法鉴定病毒滴度，并在人肝癌Huh7细胞和小鼠肝脏组织中验证该病毒的干扰效率。结果 成功构建了人鼠通用的ZBTB20基因干扰腺病毒载体，获得高活性的ZBTB20干扰腺病毒Ad-shZBTB20，滴度为3.2x1010 IU/ml。该干扰腺病毒感染人肝癌细胞株96 h可使ZBTB20 mRNA降低至对照的20%；尾静脉注射7天后可显著下调肝脏内源性ZBTB20蛋白的表达，并使其靶基因甲胎蛋白mRNA表达水平升高200倍以上。结论 所制备的ZBTB20干扰腺病毒能有效抑制人和小鼠ZBTB20的蛋白表达及其生物学效应，为ZBTB20功能研究和干预应用提供技术手段。     

慢病毒介导LOX-1基因RNA干扰抑制氧化应激诱导心肌细胞凋亡

摘要：目的构建大鼠凝集素养氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）RNA干扰慢病毒表达载体并观察LOX-1在氧化应激诱导心肌
细胞凋亡中的作用。方法设计针对大鼠LOX-1的shRNA序列,将shRNA序列插入到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒载体中,构
建慢病毒载体pLL3.7-LOX1。慢病毒载体及包装载体dR8.9、VSVG共转染293FT细胞包装慢病毒。慢病毒侵染H9C2大鼠心
肌细胞,RT-PCR鉴定对LOX-1抑制效率,CCK-8、Hochest33258染色检测LOX-1对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结
果通过双酶切鉴定,证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,抑制LOX-1能抑制H2O2诱导的细胞活
力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较均有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建靶向大鼠LOX-1基因RNAi
慢病毒载体,LOX-1激活可能在H2O2诱导心肌细胞凋亡中发挥重要作用。
     

含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。     

神经营养素4前导序列介导Exendin-4表达质粒的构建及鉴定

目的：构建神经营养素4前导序列介导的可分泌表达Exendin-4的重组腺伴病毒载体,为探究Exendin-4用于2型糖尿病临床治疗提供实验基础。方法：使用互补引物/模板法及Ｔ载体克隆法扩增Exendin-4的cDNA克隆,连接于NT4前导肽序列的3′端,融合基因NT4- Exendin-4亚克隆于穿梭质粒pSSHG,转染HEK-293细胞,包装病毒,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果：经酶切、测序证实克隆出Exendin-4 cDNA,成功构建同一开放读码框ORF的NT4前导肽-Exendin-4cDNA克隆,得到高滴度（2.5×10⁹ pfu·L^-1） 的重组腺相关病毒。结论：通过分子克隆技术成功制备了Exendin-4的重组腺伴病毒载体pSSHG /NT4- Exendin-4并成功包装了较高浓度的重组病毒,为进一步研究Exendin-4功能及应用于临床打下基础。     

RNA干扰沉默HIF-1α基因对卵巢癌SKOV3细胞定植和侵袭的影响

【目的】构建针对HIF-1α基因的短发夹干忧RNA真核表达质粒，探讨低氧条件下其对卵巢癌SKOV3细胞定植和侵袭能力的影响。【方法】根据siRNA设计原则，结合psilencer 2．1-U6-neo质粒特点，针对HIF-1α基因设计并合成2条寡聚DNA片段，退火后将其克隆人DSilencer2．1-U6-neo质粒中，采用脂质体法将重组真核表达质粒转染人卵巢癌SKOV3细胞。缺氧培养后，应用实时定量PCR和Western blotting方法检测HIF-1α蛋白及mRNA表达水平；用软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测SKOV3细胞的定植和侵袭能力。【结果】成功构建的HIF-1α的短发状siRNA真核表达载体，转染卵巢癌SKOV3细胞，低氧条件下细胞HIF-1蛋白及mRNA表达水平下降；同时SKOV3细胞在软琼脂中形成的克隆数和穿透Matrigel膜的细胞数明显减少。【结论】构建的HIF-1α短发状siRNA真核表达载体，下调卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因表达，卵巢癌细胞的定植和侵袭能力降低。     

高糖负荷下人蛋白激酶Cβ_2基因过表达内皮细胞模型的构建及鉴定

目的 应用AdMax系统构建含人蛋白激酶Cβ_2(protein kinase Cβ_2,PKCβ_2)基因的重组腺病毒载体,转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),高糖刺激下观察蛋白量的表达,构建进一步功能研究的细胞模型.方法 从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1.所得片段定向克隆至穿梭质粒pDC315上,后与骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染293细胞,经同源重组构建腺病毒Ad-PRKCB1,TCID50测定重组病毒的滴度,免疫细胞化学和RT-PCR方法进行鉴定.构建成功后转染HUVEC,激光共聚焦显微镜(LSCM)下,观察高糖刺激下荧光蛋白转位及表达量,鉴定细胞模型构建.结果 通过酶切鉴定目的 片段正确插入穿梭质粒.倒置显微镜下观察到细胞的病变效应.测得病毒滴度为7.9×10~9IU/ml,免疫细胞化学和RT-PCR验证了目的 蛋白表达.LSCM下观察到高糖负荷下荧光蛋白转位及过表达.结论 成功构建了含PRKCB1基因的重组腺病毒载体并在高葡萄糖负荷下观察到其活化及蛋白过表达,为下一步信号蛋白组学研究提供分子工具.     

小鼠雌激素受体α基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建C57BL/6小鼠雌激素受体α（Esr1）重组腺病毒表达载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞扩增目的Esr1 CDS区基因片段,至pMD19-TSimple载体后测序鉴定.亚克隆Esr1CDS区基因片段至腺病毒穿梭质粒pDNR-CMV,再与骨架质粒pLP-Adeno-X-CMV在感受态大肠杆菌ElectroMAXTMDH10BTMCells中进行同源重组获得腺病毒载体质粒Adeno-Esr1,PacI酶切线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,测定感染性滴度,获得重组腺病毒Ad-Esr1.将病毒感染HEK293细胞,Western Blot检测Esr1蛋白表达.结果：测序证实提取的Esr1 CDS区基因序列完全正确;测序及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;感染性滴度为6.4×1013（pfu/L）,Western Blot检测Ad-Esr1感染的HEK293细胞能表达Esr1蛋白,而未感染的HEK293细胞蛋白不表达.结论：成功构建了C57BL/6小鼠Esr1基因重组腺病毒载体,为进一步研究Esr1在神经系统中生物学功能及对神经系统疾病的基因治疗奠定了基础.     

以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体

目的 构建肾癌相关抗原G250重组腺病毒载体,以期用于基因转染树突状细胞(DC)治疗肾癌的实验研究.方法 利用AdMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC316-G250,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre以CaCL2法质粒共转染293细胞得到重组腺病毒Ad/G250,CsCl梯度离心纯化病毒,TCID50法测定病毒滴度.Ad/G250转染DC细胞,RT-PCR及流式细胞仪检测G250的表达.结果 采用双质粒共转染293细胞,Cre/loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含外源基因的Ad/G250载体.经过PCR、RT-PCR和流式细胞仪证实腺病毒载体构建成功.病毒经过CsCl梯度离心纯化后,Ad/G250滴度达到5.6×109 U/ml.RT-PCR及流式细胞仪显示Ad/G250在DC中特异性表达.结论 成功构建了G250重组腺病毒载体.