利用CRISPR/Cas9技术体内标记示踪小鼠内源性NPC1L1蛋白

目的:对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行标记和示踪,为研究体内胆固醇的吸收机制提供新的技术手段。方法:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3′末端非编码区,设计不同sgRNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas9/sgRNA核酸酶活性,筛选出高活性的sgRNA序列,经体外转录制备sgRNA和Cas9 mRNA。PCR扩增基因打靶的两侧同源臂,与FLAG-EGFP的编码cDNA一起克隆至打靶载体。经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sgRNA、Cas9 mRNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育;通过基因组DNA 的PCR和Southern 印迹分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠。制备小肠组织冰冻切片,荧光显微镜下观察NPC1L1-EGFP的表达分布。结果:成功构建了NPC1L1基因敲入打靶载体,筛选了高活性的sgRNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代小鼠,荧光显微镜下观察到该融合蛋白分布于小肠绒毛上皮细胞的刷状缘,与NPC1L1的分布特征一致。结论:成功实现了对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行体内标记,为研究NPC1L1囊泡转运和胆固醇吸收机制提供了有效手段。     

电穿孔法介导siRNA高效转染小鼠原代软骨细胞

目的：建立小鼠原代软骨细胞高效电转siRNA的方法。方法常规分离得到的小鼠原代软骨细胞继续用链丝菌蛋白酶消化3h,然后应用高效电转缓冲液和优化的电转参数转染pCMV－EGFP表达质粒或siRNA,用台盼蓝检测细胞存活率;转染后48h分析转染效率和siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平。结果电穿孔后原代软骨细胞的存活率＞80％,质粒的转染效率达到37．3％±5．2％;siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平分别下调了75％和66％。结论成功建立了通过电穿孔介导siRNA转染小鼠原代软骨细胞的方法,达到了很好的基因沉默效果且保持了较高的细胞存活率。     

抗新型锌指蛋白ZBTB45单克隆抗体的制备与应用

目的制备新型锌指蛋白ZBTB45的单克隆抗体,建立该分子的体内外免疫学检测方法,为研究其生物学功能提供技术手段。方法制备小鼠ZBTB45的多表位抗原融合蛋白,免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA检测、多次有限稀释亚克隆建立分泌ZBTB45单克隆抗体的杂交瘤细胞株,从荷瘤小鼠的腹水中通过蛋白A柱纯化单克隆抗体,鉴定分析所制备抗体在免疫印迹、免疫沉淀和免疫组织化学中的应用效果。结果成功制备了6株抗ZBTB45的特异性单克隆抗体,其中3E5、2G4、4D2和1D4可成功用于免疫印迹和免疫沉淀分析,3E5、6D8和8E3可用于免疫组织化学检测内源性ZBTB45,具有较好的敏感性、特异性。结论首次成功制备了抗ZBTB45单克隆抗体,可应用于体外和体内的免疫学检测,为深入研究ZBTB45的生物学功能提供了技术支持。     

抗新型锌指蛋白ZBTB20单克隆抗体的制备和鉴定

目的： 制备新型锌指蛋白ZBTB20的单克隆抗体,建立敏感和特异的ZBTB20免疫学检测方法,为其生物学功能研究提供技术支持。方法：将经ZBTB20多肽免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,用ZBTB20的GST融合蛋白为包被抗原进行ELISA筛选,经4次亚克隆后建立稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化抗体,鉴定其在免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化中的应用效果。结果：成功制备了8株抗ZBTB20单克隆抗体,在不同的免疫学检测中均得到成功应用,尤其是单克隆抗体9A10具有敏感性高、特异性好和通用性强等优点。结论：首次成功制备了ZBTB20单克隆抗体,可应用于免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化等免疫学检测,对ZBTB20的功能研究具有重要意义。     

脂肪肝小鼠的肝脏脂质代谢相关基因表达特征分析

目的 分析ob/ob肥胖小鼠脂肪肝中脂质代谢相关基因的表达特征.方法 18周龄雄性ob/ob及其同窝对照小鼠各4只,禁食16h后处死.检测小鼠体质量、肝脏湿质量/体质量、肝脏三酰甘油(TG)水平;用H-E和油红O染色观察肝脏的形态结构和脂质沉积情况;用实时荧光定量PCR方法检测肝脏脂质代谢相关基因的mRNA表达情况.结果 Ob/ob小鼠体质量、肝脏湿质量/体质量和肝脏组织TG水平均高于对照小鼠(P＜0.05),H-E和油红O染色显示ob/ob小鼠发生肝脏脂质沉积;肝脏脂肪酸转位酶(CD36)、脂肪酸结合蛋白1(FABP1)、脂肪酸合酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、极长链脂肪酸延长酶6(ELOVL6)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)等mRNA表达水平在ob/ob小鼠肝脏均高于对照小鼠(P＜0.05),而过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)、软脂酸辅酶A氧化酶1(ACOX1)、载脂蛋白B(ApoB)和微粒体TG转移蛋白(MTP) mRNA在两组小鼠肝脏中的mRNA表达水平差异无统计学意义.结论 Ob/ob小鼠肝脏的脂肪酸摄取和从头合成相关基因的mRNA表达水平升高,而脂肪酸氧化及脂质向肝外转运的相关基因的mRNA表达水平无明显改变.     

醛缩酶B在果糖耐受与血糖稳态中的作用研究

目的：建立全身性醛缩酶B(aldolase B,Aldob)基因敲除小鼠模型,探讨Aldob基因缺陷对小鼠果糖耐受和血糖稳态的影响。方法：利用敲除优先策略和胚胎干细胞基因打靶技术,建立全身性Aldob基因敲除小鼠模型,并通过Western blot验证敲除效果;监测普食喂养小鼠生长发育过程中的体重、体长、血糖和血脂水平;检测果糖灌胃前后小鼠血糖及血浆天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）水平,取材分析肝、肾等器官的大小及形态学变化。结果：Aldob缺陷小鼠普食喂养时出现生长迟滞和低血糖;果糖灌胃后血糖呈降低趋势,血浆AST和ALT水平升高,并伴有肝肾肿大和肝脏病理性损伤。结论：Aldob在维持小鼠生长、血糖稳态和果糖耐受性中发挥重要作用。     

介绍一种快速提取胎鼠基因组DNA进行基因型分析的改良方法

目的 建立一种快速提取胎鼠基因组DNA进行基因型分析的简便方法.方法 先对胎鼠组织进行碱裂解,然后通过盐析纯化DNA,经琼脂糖凝胶电泳判断DNA大小,检测A260/A280的比值判断其纯度,最后将抽提的DNA进行PCR扩增和基因型分析,检测其作为PCR模板的稳定性.结果 在2h内能分离到胎鼠基因组DNA,片段完整没有明显的降解现象,A260/A280比值＞1.77,能稳定用于PCR基因型鉴定分析.结论 该方法简便、快速、经济,能得到PCR级的高质量胎鼠基因组DNA,为准确和快速地进行胎鼠的基因型分析提供保证,具有很好的稳定性、可靠性和实用性.     

碳水化合物反应元件结合蛋白条件性基因敲除小鼠模型的建立及鉴定

目的 建立转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）的条件性基因敲除小鼠模型,为研究ChREBP的体内生物学功能提供技术手段。方法和结果 利用Cre/loxP基因打靶策略,通过构建基因打靶载体和基于胚胎干细胞（ES细胞）的基因同源重组,在ChREBP基因第8外显子的两侧分别引入loxP位点;将打靶成功的ES细胞显微注射至小鼠囊胚,然后植入假孕雌鼠子宫获得嵌合鼠,进一步获得可种系传代的ChREBP^flox/+小鼠;将ChREBP^flox/+小鼠与Alb-Cre小鼠交配,获得ChREBP的肝脏特异性基因敲除小鼠。结论 建立了ChREBP条件性基因敲除小鼠模型,为揭示不同组织中ChREBP的生理功能和病理学意义提供了重要手段。     

优化整体原位杂交方法检测基因在幼鼠大脑中的表达

目的 优化整体原位杂交方法,用于检测基因在幼鼠大脑中的时空表达分布。方法 通过摸索最佳蛋白酶K的消化时间,改良杂交缓冲液成分,并延长杂交时间和漂洗时间,对整体原位杂交方法进行优化,并用优化的方法检测了Cdh6、Bhlhb5和Lmo4mRNA在出生后7天的小鼠大脑中的整体表达分布。结果 采用优化的整体原位杂交方法成功地检测了3种mRNA在幼鼠全脑的区域性表达特征,特异性杂交信号强,非特异性背景低。结论 成功优化了幼鼠全脑原位杂交方法,为开展后续的研究打下基础。     

ZBTB20基因干扰腺病毒的制备及功能鉴定

目的 制备靶向锌指蛋白ZBTB20基因的干扰腺病毒。方法 根据ZBTB20基因序列设计人鼠通用的干扰序列，定向克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-U6-GFP的BamHⅠ和HindⅢ位点。PmeⅠ酶切线性化的重组穿梭载体pShuttle-shZBTB20导入含有腺病毒载体pAdEasy-1的细菌，使同源重组产生重组腺病毒载体pAd-shZBTB20。用PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒载体，转染293A细胞以包装腺病毒颗粒，用TCID50法鉴定病毒滴度，并在人肝癌Huh7细胞和小鼠肝脏组织中验证该病毒的干扰效率。结果 成功构建了人鼠通用的ZBTB20基因干扰腺病毒载体，获得高活性的ZBTB20干扰腺病毒Ad-shZBTB20，滴度为3.2x1010 IU/ml。该干扰腺病毒感染人肝癌细胞株96 h可使ZBTB20 mRNA降低至对照的20%；尾静脉注射7天后可显著下调肝脏内源性ZBTB20蛋白的表达，并使其靶基因甲胎蛋白mRNA表达水平升高200倍以上。结论 所制备的ZBTB20干扰腺病毒能有效抑制人和小鼠ZBTB20的蛋白表达及其生物学效应，为ZBTB20功能研究和干预应用提供技术手段。