小鼠骨髓源性树突状细胞和DC2.4中RelB基因表达水平的比较研究

目的比较研究体外分离培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞(bonemarrow-deriveddendriticcells,BM-DC)和DC2.4中核转录因子RelB基因的表达水平。方法无菌从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中取出骨髓细胞,利用rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导体系扩增骨髓前体细胞的方法产生未成熟的BM-DC,未成熟的BM-DC在培养结束前18h经LPS刺激获得成熟的BM-DC;DC2.4细胞系用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液于37℃,5%CO2条件孵箱中培养。用流式细胞术分析它们的表型,用RT-PCR和免疫荧光染色法检测成熟的BM-DC、未成熟的BM-DC和DC2.4,RelBmRNA和其蛋白的表达。结果流式细胞术分析显示MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40在未成熟的BM-DC和DC2.4中均呈低水平表达,在成熟的BM-DC中则呈高水平表达;共刺激分子CD86在成熟的BM-DC和DC2.4中均呈高水平表达,而在未成熟的BM-DC中呈低水平表达。RT-PCR和免疫荧光染色法检测结果均显示,RelB基因在未成熟的BM-DC和DC2.4中均呈低水平表达;而在成熟的BM-DC中呈高水平表达,成熟的BM-DC与未成熟BM-DC及DC2.4均存在显著差异(P<0.01)。结论RelB基因的表达与小鼠BM-DC的成熟状态密切相关。RelB基因在DC2.4中呈低水平表达,提示DC2.4是一种不成熟的DC细胞系。DC2.4具有的未成熟DC的特点可能与RelB基因的低水平表达有一定关系。抑制骨髓DC中RelB基因的表达,有可能诱导产生具有耐受原性的未成熟的DC。     

核转录因子RelB抑制途径对骨髓树突状细胞表面分子表达的影响研究

目的 探讨核转录因子RelB抑制途径对小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow dendritic cells)的表面分子表达的影响,为致耐受树突状细胞的研究提供新方法.方法 rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导培养体系培养小鼠骨髓树突状细胞,免疫磁珠方法纯化;用慢病毒载体制备RelB shRNA慢病毒,与小鼠骨髓树突状细胞共培养,流式细胞术观察树突状细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40的表达,设LPS-DC对照组、未处理组和LPSRNAi RelB DC组.结果 核转录因子RelB抑制的树突状细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40均低水平表达,显著低于成熟Dc表面分子的表达(P<0.05),且经LPs刺激后(LPS RNAi RelB DC)DC表面上述三类分子的表达水平仍显著低于LPS-DC组(P<0.05),与未处理组(immature DC)表面分子表达水平相当.结论 核转录因子RelB抑制的骨髓树突状细胞表面分子表达水平低,呈现出致耐受的树突状细胞的特点,是致耐受树突状细胞研究的一种新方法.     

雷帕霉素对未成熟树突状细胞RelB表达的影响研究

目的:研究雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)RelB表达的影响,为回输RAPA处理的imDC(RAPA-imDC)诱导移植耐受的机制研究提供实验依据。方法:分离诱导imDC、RAPA-imDC、成熟树突状细胞(mature dendritic cell,mDC),光镜和电镜观察其形态,流式细胞仪检测其CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达,用免疫荧光法检测其RelB表达。结果:①电镜结果显示imDC与RAPA-imDC形态相似,呈未成熟状态,树突少、粗短;mDC树突较多,细长。②mDC表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达显著高于imDC和RAPA-imDC(P<0.05);而imDC的表达也明显高于RAPA-imDC(P<0.05)。③免疫荧光法检测结果显示imDC、RAPA-imDC RelB表达量无显著变化,而mDC表达量高。结论:雷帕霉素能降低imDC表面的CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达,但对其RelB表达没有明显影响。     

一种改良的小鼠诱导多功能干细胞(iPS)向树突状细胞(DC)分化的方法

 目的  建立一种简便经济的小鼠诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS)向树突状细胞(dendritic cell, DC)分化的方法。方法  采用三段式培养法,将iPS细胞培养于op9细胞上,使用添加细胞因子GM-CSF(10 ng/mL)和 IL-4(10 ng/mL)的培养液,经过17天的培养收集到iPS诱导的DC,通过显微镜及细胞涂片观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面分子,抗原吞噬实验和混合淋巴细胞培养实验等对其形态、表面分子及细胞功能进行检测及评估。结果  本研究获得的iPS-DC在细胞形态上表现出明显的树突状特征;细胞表型上呈CD11b、CD11c双阳性;未经脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激的细胞呈未成熟DC的状态:细胞表面的第一信号分子MHCⅡ及第二信号分子CD40、CD80、CD86低表达,具有很强的抗原吞噬能力;经LPS刺激后细胞具有成熟DC的特征:MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表达均增高,同时具备对初始T细胞的激活能力。结论  本研究改良了小鼠iPS 细胞向DC分化的方法,缩短了培养时间,节省了培养成本。     

小鼠肝癌细胞外泌体对树突状细胞成熟与功能的影响

目的 探讨小鼠肝癌细胞(Hepa1-6)来源的外泌体对树突状细胞成熟和功能的影响.方法 提取小鼠Hepa1-6细胞的外泌体,用透射电镜来鉴定外泌体的外形,Western blot方法测定外泌体的标志蛋白CD63和TSG101的表达,使用小鼠Hepa 1-6细胞外泌体冲击树突状细胞(DCs),DCs成熟相关表面分子CD40、CD80、CD83、CD86、MHC-Ⅱ的表达使用流式细胞术检测;将小鼠T淋巴细胞和小鼠Hepa1-6细胞外泌体致敏的DCs一起孵育5d,使用CFSE染色标记和流式法来测定共孵育T细胞的分裂增殖情况.结果 透射电镜可以观察到从Hepa1-6细胞的上清液中收集到的外泌体,表现为圆形或类圆形膜性囊泡样结构,符合外泌体的典型特征;Western blot检测表明小鼠Hepa1-6细胞来源的外泌体表达CD63、TSG101标志性蛋白,不表达细胞色素C;从小鼠Hepa1-6细胞提取来的外泌体致敏DCs,可上调表面MHC-Ⅱ类分子、成熟标志分子CD83和共刺激分子CD40、CD80、CD86(P ＜0.05).且随着外泌体浓度的增加,DC表面分子表达增高;同时可促进T淋巴细胞的增殖(P＜0.05).结论 小鼠Hepa 1-6细胞提取的外泌体可促进DC2.4的朝向成熟表型分化,并促进T细胞的增殖.     

大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养

目的 建立大鼠脾脏树突状细胞(DCs)的体外分离和培养方法,并进行相关鉴定.方法 根据DC低密度和短暂黏附的特点,用梯度密度离心方法分离出大鼠脾脏DC前体和单核细胞,在加入30 ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DMEM培养基中,分别培养7 d和14 d后收集细胞,流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62、CD80、CD86和主要组织相容性复合物-Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的表达情况.结果 新鲜分离的大鼠脾脏DCs细胞呈圆形, 胞体小,在培养液中悬浮生长;表面抗原表达很低.诱导分化7 d时,部分细胞体积增大且形态不规则,表面呈毛刺样,细胞核大而不规则; MHC-Ⅱ分子呈较高水平表达,CD80、CD86表达较低.诱导分化14 d时,大部分细胞呈现典型的树突状细胞的形态; MHC-Ⅱ分子呈高表达,CD80、CD86表达增加,OX62表达阳性率为25.0% ～86.2%.结论 密度梯度离心结合较低浓度GM-CSF+IL-4培养,是大鼠脾脏DCs体外分离和培养的简单、经济且有效的方法.     

大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养

目的建立大鼠脾脏树突状细胞(DCs)的体外分离和培养方法,并进行相关鉴定。方法根据DC低密度和短暂黏附的特点,用梯度密度离心方法分离出大鼠脾脏DC前体和单核细胞,在加入30ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DMEM培养基中,分别培养7d和14d后收集细胞,流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62、CD80、CD86和主要组织相容性复合物-Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的表达情况。结果新鲜分离的大鼠脾脏DCs细胞呈圆形,胞体小,在培养液中悬浮生长;表面抗原表达很低。诱导分化7d时,部分细胞体积增大且形态不规则,表面呈毛刺样,细胞核大而不规则;MHC-Ⅱ分子呈较高水平表达,CD80、CD86表达较低。诱导分化14d时,大部分细胞呈现典型的树突状细胞的形态;MHC-Ⅱ分子呈高表达,CD80、CD86表达增加,OX62表达阳性率为25.0%~86.2%。结论密度梯度离心结合较低浓度GM-CSF IL-4培养,是大鼠脾脏DCs体外分离和培养的简单、经济且有效的方法。     

Foxp3,Galectin-9,PD-L1在小鼠DC2.4细胞的表达

目的观察CD80,CD86,Foxp3,Galectin-9,PD-L1在小鼠DC细胞的表达,了解小鼠DC2.4细胞系的免疫学特性。方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养小鼠DC2.4细胞,光学显微镜观察细胞形态;流式细胞术检测CD80,CD86,Foxp3,Galectin-9,PD-L1在DC2.4细胞表达。结果光学显微镜示小鼠DC2.4细胞贴壁生长,呈树突、梭形及不规则形;流式细胞术检测DC2.4细胞CD80表达为91.04%±4.90%,CD86表达为98.54%±1.96%,Foxp3无或微表达,Galectin-9表达为14.33%±2.94%,PD-L1表达为98.80%±0.63%。结论小鼠DC2.4细胞是一个高表达CD80,CD86及PD-L1,低表达Galectin-9,无或微表达Foxp3的细胞系。     

消炎痛对活化小胶质细胞MHC-Ⅱ类分子和CD11b分子表达的影响

目的 探讨消炎痛对活化小胶质细胞MHC-Ⅱ类分子和CD11b分子表达的影响.方法 脂多糖(LPS)联合干扰素γ(IFN-γ)激活小胶质细胞株BV-2的同时采用不同浓度(0.1、0.5、1 mmol/L)的消炎痛进行干预,流式细胞仪检测表面分子MHC-Ⅱ类分子和CD11b分子的表达,Griess法检测培养上清中一氧化氮(NO)的浓度.结果LPS联合IFN-γ激活BV-2细胞后MHC-Ⅱ类分子和CD11b分子的表达上调,NO的生成增加;消炎痛以剂量依赖方式下调活化的BV-2细胞MHC-Ⅱ类分子和CD11b分子的表达,抑制NO的生成.结论 消炎痛下调BV-2细胞MHC-Ⅱ类分子和CD11b分子的表达并抑制NO的生成,提示消炎痛可能通过降低小胶质细胞免疫相关分子表达,抑制活化小胶质细胞的抗原提呈功能、吞噬杀伤及细胞毒效应.     

CD40配体刺激人外周血来源B细胞的长期培养及增殖活化

目的 建立外周血来源B细胞体外长期培养体系,观察培养过程中B细胞的增殖活化及抗原提呈功能.方法 利用重组人可溶性CD40配体(sCD40L)刺激人外周血B细胞的长期培养过程中,流式细胞技术检测B细胞DNA周期及B细胞表面CD80、CD86、主要组织相容复合物(MHC)Ⅰ类及Ⅱ分子的表达状况;观察B细胞增殖情况及B细胞活化后表面分子的表达.采用乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)-异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗原多肽与B细胞共孵育,检测B细胞对抗原多肽的负载能力.结果 人外周血B细胞在sCD40L培养体系中可长期培养达50 d,在此期间,B细胞绝对计数增加近10倍,外周血B细胞比例由8.21%增高到70.67%,活化的B细胞高表达CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ,并可负载HBV核心抗原肽.结论 sCD40L培养体系可在体外长期培养人外周血B细胞,并使B细胞增殖活化,具有抗原提呈细胞的特征.     

小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定

目的建立小鼠骨髓源树突状细胞（bonetnarrowdendriticcell,BMDC）的培养方法并对其表型和功能进行鉴定．方法无菌取BALB/c小鼠股骨、胫骨中的骨髓细胞,以粒一巨噬细胞集落刺激因子体外诱导分化为BMDC,倒置显微镜动态观察BMDC增殖和形态变化情况,流式细胞术分析细胞表型,并检测其抗原吞噬功能．结果小鼠骨髓细胞体外诱导可获得大量未成熟和成熟BMDC,呈现典型的树突状形态．未成熟BMDC的细胞表型为CDllchighCD40lowcD86lowMHC—Illow,具有较强的抗原吞噬能力．未成熟BMDC经细菌脂多糖刺激后可分化为高表达CD11c、CD40、CD86及MHC—II类分子的成熟BMDC．结论体外诱导培养可获得小鼠骨髓来源的未成熟和成熟DC。     

GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞成熟和功能的调控作用

目的探讨GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞（BMDC）成熟和功能的调控作用。方法脂多糖催熟BMDC,Western blotting
检测刺激前后糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的磷酸化水平的改变;利用GSK-3β的选择性抑制剂SB216763处理BMDC,检测表
型、细胞因子表达和混合淋巴反应（MLR）的变化情况;构建过表达小鼠GSK-3β的慢病毒载体并转染DC2.4 细胞,Western
blotting检测过表达GSK-3β对调控树突状细胞（DC）成熟的关键调控因子鸟的网状内皮组织增生病毒癌基因相关B（RelB）蛋
白水平的影响。结果经脂多糖处理后,GSK-3βY216磷酸化水平下调,Ser9磷酸化水平显著上调,表明GSK-3β的活性显著下
降。抑制GSK-3β的活性能上调DC表面共刺激分子CD40和CD86的表达,削弱脂多糖诱导的促炎细胞因子IL-6和IL-12表达
上调,而对抗炎细胞因子IL-10的表达有促进作用,同时降低脂多糖诱导成熟的DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力。在未成
熟的DC2.4细胞中,过表达GSK-3β能够下调RelB的水平。结论GSK-3β参与调控DC的成熟和功能,高活性的GSK-3β抑制未
成熟树突状细胞（iDC）的自发性成熟,GSK-3β失活后促进DC表型的成熟,而在脂多糖诱导DC分化的过程中GSK-3β发挥促炎
作用。GSK-3β能够下调RelB的蛋白水平,有望成为构建新型耐受性DC的新靶点。
     

CD137信号对小鼠树突状细胞表面TLR4表达的调节

目的 探讨CD137（4-1BB）激发型单克隆抗体2A对小鼠未成熟树突状细胞株DC2.4表面TLR4表达的调节。方法 以流式细胞术检测不同剂量2A、LPS,或LPS预刺激后再加入2A等因素作用下,DC2.4表面的TLR4表达情况。结果 LPS下调TLR4表达,2A使DC2.4上TLR4表达上调,并拮抗LPS对TLR4的下调作用。LPS预处理后再加入2A,也拮抗LPS的下调作用。结论 CD137信号可以上调DC2.4表面TLR4的表达。     

中性粒细胞诱导适应性免疫应答过程中树突状细胞成熟活化

目的 探讨T辅助（Th）1细胞免疫应答过程中,中性粒细胞（PMN）对树突状细胞（DC）的调节作用。方法 将脂多糖（LPS）刺激的中性粒细胞（LPS-PMN）和未成熟树突状细胞（imDC）共培养,流式细胞术检测DC表面CD40和CD86,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）。将与LPS—PMN共培养后DC（PMN-DC）提纯,与FITC标记的卵清蛋白（FITC-OVA）培养,检测其吞噬功能。将PMN-DC与D011．10T细胞和OVA17肽共培养,计活细胞数,胞内染色测干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）。结果 LPS-PMN可刺激imDC CD40和CD86上调并分泌IL-12、肿瘤坏死因子（TNF）-α,且这种能力能被抗TNF-α单抗所抑制。与imDC对照,PMN—DC吞噬功能下降,能显著刺激D011．10T细胞增殖,分泌高水平IFN-γ、少量IL-4。结论 LPS-PMN具有促使imDC成熟活化,刺激其分泌细胞因子,发挥其在Th1免疫应答中抗原呈递,促进Th1分化的作用。     

细胞接触对NK细胞及DC间免疫调节的影响

目的探讨自然杀伤细胞(NK)促进树突状细胞(DC)成熟及诱导细胞因子产生的作用,及是否依赖于细胞接触。方法体外培养NK及未成熟DC,并按1∶5、1∶1、5∶1的比例进行接触与非接触式共培养,抗CD86-FITC标记抗体流式细胞术分析DC的CD86表达水平,酶联免疫吸附法检测培养液中TNF-α、IL-12p40含量。结果随着NK/DC比例的升高,表达CD86+DC增多,而DC分泌的TNF-α、IL-12p40呈指数量降低,非接触共培养使DC表达CD86及分泌TNF-α、IL-12p40明显降低。结论NK具有促进DC成熟的作用,并能调节DC细胞因子的分泌,这种免疫调节作用依赖于细胞间接触。     

反义肽核酸对树突状细胞CD86表达的抑制作用

目的 探讨CD86mRNA反义肽核酸（peptide nucleic acid,PNA)阻断树突状细胞CD86表达和第二信号传递的可能作用。方法 采用激光共聚焦显微镜研究生物素化PNA的细胞内化；利用流式细胞术，荧光细胞组织化学以及RT-PCR研究CD86反义PNA对CD86分子表达的抑制作用，结果 （1）激光共聚焦显微镜光学细胞切片证明，培养的人未成熟树突状细胞能够有效内化生物素化PNA。（2）流式细胞术和荧光细胞组织化学证实CD86反义PNA在蛋白质水平上对CD86分子表达有抑制作用。（3）RT-PCR证明反义PNA能够抑制DCCD86mRNA水平。结论 CD86反义PNA能够抑制人树突状细胞CD86mRNA的表达，从而为进一步利用反义PNA阻断第二信号传递，诱导免疫耐受奠定了基础。     

脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞向树突状细胞的分化

目的探讨人脐静脉内皮细胞对人脐血单个核细胞(UBMCs)向树突状细胞(DC)分化的影响,建立更便捷、更经济体外培养DC的方法。方法胶原酶消化分离出脐静脉内皮细胞(HUVEC),经鉴定和体外培养扩增后,使其平铺生长于Tran-swell板上室底部,将UBMCs接种到Transwell小室内,同时加入EC9706细胞冻融形成的蛋白质抗原,与HUVEC共培养,使UBMCs与HUVEC紧密接触并从Transwell板上室迁移到下室,收集Transwell板下室细胞,流式细胞术检测下室细胞DC相关表面标志CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC分子;通过MTT法检测肿瘤负载的UBDC诱导CTL对靶细胞的特异性杀伤作用。结果经HUVEC诱导并负载了肿瘤细胞抗原的DC CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC-Ⅱ类分子表达增加,产生的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性杀伤食管癌细胞EC9706;与细胞因子诱导DC活化的CTL对EC9706的杀伤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用Transwell小室以人原代脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞分化的DC是可行的一种实验方法。