慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞研究

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stemcells,BMSCs）并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法利用密度梯度离心法分离、纯化、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。以脂质体法进行慢病毒感染大鼠BMSCs。结果分离培养出大鼠BMSCs,并用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒成功感染大鼠BMSCs。结论获得大鼠BMSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为骨髓间充质干细胞基因治疗研究奠定了基础。     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）,检测目的基因在BMSCs中mRNA和蛋白水平是否有表达。方法采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs;将携带hHCN4基因的重组腺病毒转染大鼠BMSCs,用荧光显微镜观察转染后BMSCs绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR和Western Blot法检测转染后hHCN4基因mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 BMSCs成功贴壁分离传代。转染目的基因24 h后荧光显微镜下即观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测到有hHCN4 mRNA的表达,Western blot法检测到有其蛋白水平的表达。结论重组腺病毒载体转染的BMSCs能够表达hHCN4基因。     

3种体外培养方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化效果比较

目的：采用3种体外培养方法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导分化,探讨体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最佳方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离培养大鼠BMSCs,分为5-氮胞苷（5-aza）组、扩张型心肌病（DCM）模型大鼠心肌细胞裂解液组和DCM模型大鼠血清+5-aza组,同时设对照组（同等条件下在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养）,观察细胞形态表现,采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫组织化学染色法检测细胞中肌钙蛋白T（cTnT）的表达。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法获得大鼠BMSCs,BMSCs高表达间充质干细胞（MSCs）的特征性表面标记CD44、CD29和CD105,不表达造血干细胞的特征性表面标志CD34;特定诱导条件下,BMSCs可以向成骨细胞及脂肪样细胞分化。体外3种培养方法均可诱导BMSCs表达cTnT,分化为心肌样细胞;5-aza组细胞生长状态差,其余2组细胞生长状态较好,DCM模型大鼠血清+5-aza组细胞中cTnT阳性表达率最高。结论：采用DCM模型大鼠血清联合5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化的效果最佳。     

表达大鼠融合蛋白NKX2.5-pEGFP的骨髓间充质干细胞的建立

目的：构建大鼠NKX2.5融合绿色荧光蛋白真核表达质粒NKX2.5-pEGFP,并筛选达
大鼠融合蛋白NKX2.5- pEGFP 的骨髓间充质干细胞(MSCs),为后续性细胞和基因治疗心肌梗死提供理论基础。方法:提取胎鼠心肌细胞总RNA,RT-PCR扩增获得大鼠NKX2.5基因,将目的基因克隆到pEGFP-N3载体并获得重组后NKX2.5-pEGFP质粒。采用密度梯度离心法联合贴壁法分离骨髓单个核细胞并获得MSCs。将重组质粒NKX2.5-pEGFP 以 Lipo2000 转染到大鼠MSCs,G418筛选2周。蛋白免疫印记和荧光检测重组后质粒在骨髓间充质干细胞中的表达情况。结果：电泳检测证实经RT-PCR获得 NKX2.5 基因大小为981 bp,与理论值相符。NKX2.5- pEGFP重组质粒经BamHⅠ、Sal Ⅰ双酶切,PCR鉴定得到2条大小约为981和4 700 bp的酶切片段,鉴定结果与预期结果完全一致。蛋白免疫印记检测到转染重组质粒的MSCs中有相对分子质量为65 000的蛋白表达,与理论值相符。荧光检测NKX2.5-pEGFP重组质粒转染的MSCs中可见绿色荧光,证实表达阳性。结论：成功建立表达大鼠NKX2.5-pEGFP基因的MSCs。     

树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜进行形态学观察。用成脂诱导液(DMEM/F12+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+1.0μmol/L地塞米松+0.2 mmol/L吲哚美辛+0.01 mg/mL胰岛素+0.5 mmol/L IBMX)和成骨诱导液(高糖DMEM+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+50 ng/mL BMP-2)对分离的树鼩BM-MSCs分别定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果原代和传代细胞为梭形或三角形,可增殖形成克隆。BM-MSCs成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色可观察到矿化结节。结论密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养树鼩BM-MSCs简便可行,获得的BM-MSCs可体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。     

c-met慢病毒载体的构建及稳定转染骨髓间充质干细胞

构建肝细胞生长因子受体(c-met)慢病毒载体,并稳定转染骨髓间充质干细胞(BMSCs).将c-met连接到慢病毒载体GV358上,重组获得慢病毒载体GV358-c-met.再将该重组体与病毒辅助质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒并测定其滴度为2×108 TU/ml.将此慢病毒转染BMSCs,经嘌呤霉素筛药后,荧光显微镜下检测荧光阳性率达100%,且Western blot证实该细胞株表达c-met蛋白.成功构建了c-met慢病毒载体,并建立了稳定表达c-met的BMSCs.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的采用原代培养符合实验要求的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,进行生物学特性分析,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法采用全骨髓冲洗手段,结合密度梯度离心与贴壁培养方式体外分离兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT绘制细胞生长曲线,ALP染色试剂盒检测细胞成骨性能。结果原代培养12d后可获得纯化的兔BMSCs,经成骨条件培养液诱导培养后,形态相对稳定,具有成骨性能。结论采用骨髓冲洗结合密度梯度离心与贴壁培养方式能够成功分离培养大量较纯化的兔BMSCs,第1～3代细胞体外培养生长状态好,形态稳定且贴壁率较高,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

不同途径移植大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠肝硬化的治疗作用

目的探讨BMSCs移植治疗肝硬化的最佳移植途径。方法1.取6周龄健康SD雌性大鼠股骨骨髓,以密度梯度离心和贴壁法分离纯化BMSCs。2.体重250~300g雌性SD大鼠60只,CCl4联合酒精制做肝硬化模型。3.取模型大鼠50只随机分为对照组,尾静脉移植组,肝脏移植组,脾脏移植组,门静脉移植组,每组10只。各实验组均移植DAPI标记的BMSCs。4.3周后比较各组大鼠肝功能。结果实验各组大鼠肝功能均明显改善,其中肝脏局部移植组效果优于其他各组,其他各组之间差异无统计学意义。结论通过肝脏局部移植BMSCs治疗肝硬化比经外周静脉、门静脉、脾脏更有优势。     

骨髓间充质干细胞修复硬脊膜缺损的应用研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSC）修复兔破损硬脊膜的可行性和有效性。方法穿刺抽取日本大耳白兔髂后上棘骨髓,分离BMSC,采用贴壁筛选法对分离的BMSC进行纯化,接种于人工硬脊膜上。16只日本大耳白兔,随机分成A组、B组,每组8只,制作L4椎板切除硬脊膜破损模型,A组人工硬脊膜敷贴裂口处,B组骨髓间充质干细复合人工硬脊膜敷贴裂口处。术后30天处死动物,取修复区域的组织行大体观察和病理学观察,并对成纤维细胞密度进行分析。结果B组成纤维细胞与胶原纤维丰富,细胞密度高于A组（P〈0．05）。结论骨髓间充质干细胞可以促进硬脊膜修复。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

骨髓间充质干细胞移植在急性肝损伤大鼠肝脏内定植能力的实验研究

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在急性肝损伤大鼠肝脏内移植情况.方法:首先行大鼠骨髓间充质干细胞提取、分离和培养,传代扩增后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,用D-氨基半乳糖(1.5g/Kg)腹腔注射制备大鼠急性肝损伤模型,试验分三组(A、B、C组),经阴囊上静脉向肝损伤组(A组)及肝脏正常(C组)的大鼠移植标记BrdU的BMSCs 1～1.5x106,同时向肝损伤组(B组)的大鼠移植等量的生理盐水.2周后观察大鼠的存活率及肝功能恢复情况,并通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏中BrdU 细胞数量及分布.结果:移植2周A组、B组动物存活率、肝功能恢复情况无明显差异,肝损伤组(A组)及肝脏正常组(C组)大鼠肝脏均可检测到BrdU 细胞分布,A组与C组相比,A组BrdU 细胞数较多,分布更广,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞可以在受损的肝脏及正常肝脏定植,定植的数量可能和肝脏是否受损伤相关.     

慢病毒载体介导的 shRNA 沉默非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ A 对骨髓间充质干细胞旁分泌的影响

目的：观察慢病毒介导 shRNA 沉默非肌肉球蛋白重链ⅡA（MYH9）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）旁分泌功能的影响。方法采用脂质体法将含 MYH9干扰序列的 pHBLV －U6－ZsGreen －Puro（实验组）质粒转染到293T 细胞,以转染 pHBLV －U6－ZsGreen －Puro 空载质粒的细胞为空载组,以正常未转染细胞为对照组,包装产生的病毒液感染 BMSCs。用荧光显微镜观察荧光蛋白表达;以β－actin 为内参,分别用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT －PCR）和免疫印迹（Western blot）检测 MYH9 mRNA 及蛋白表达;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测其培养基上清液中血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、促血管生成素1（ANG －1）和促血管生成素2（ANG －2）的含量。结果成功构建重组质粒 pHBLV －U6－MYH9－ZsGreen －Puro,转染293 T 细胞产生高滴度慢病毒,荧光显微镜下可见被慢病毒感染的 rBMSCs 表达强绿色荧光蛋白,qRT －PCR 和 Western blot结果显示2条慢病毒感染 MYH9 mRNA 表达水平明显下调,显著低于对照组和空载组（P ＜0．05）;沉默 MYH9基因后,实验组的 ANG －1和 bFGF 在增殖末期较对照组和空载组有明显上升（P ＜0．05）,ANG －2和 VEGF 未见明显差异（P ＞0．05）。结论pHBLV －U6－MYH9－ZsGreen －Puro 慢病毒包装质粒转染 BMSCs 后,BMSCs 旁分泌能力未受明显影响。     

改良腺病毒AdF35-eGFP转染人 及大鼠骨髓间充质干细胞的效率对比研究

目的：比较改良腺病毒AdF35-增强绿荧光蛋白（eGFP）转染人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）和大鼠骨髓间充质干细胞(rat BMSCs, rBMSCs)的效率。方法：分别从人体、大鼠骨髓中分离出BMSCs,成骨、成脂诱导培养以鉴定BMSCs。构建含eGFP的AdF35重组腺病毒载体AdF35-eGFP,以不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别转染BMSCs后,MTT检测AdF35-eGFP对2种BMSCs的毒性作用,荧光显微镜观察eGFP的表达,流式细胞仪检测转染效率,实时定量PCR检测2种BMSCs表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)和CD46 mRNA的水平。结果：hBMSCs和rBMSCs从骨髓中分离出来后,分别成功诱导分化成骨和成脂。当MOI为1 000 PFU/mL时,AdF35-EGFP对2种BMSCs的活性均有明显抑制作用（P<0.001）。AdF35-eGFP感染hBMSCs 48 h后,荧光显微镜下可见发强烈绿色荧光的细胞,流式细胞仪检测其转染效率可达(84.8±7.1)％;Ad5-eGFP感染rBMSCs后,荧光显微镜下仅见少量发绿色荧光的细胞,48 h转染效率为(3.1±1.1)％。hBMSCs高表达CD46 mRNA,低表达CAR mRNA;而rBMSCs则高表达CAR mRNA,低表达CD46 mRNA,2种基因的表达差异有统计学意义（P<0.01）。结论：AdF35可作为理想载体携带目的基因转染hBMSCs,但不适合作为转染rBMSCs的载体。     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

转染绿色荧光蛋白-胰岛素融合基因的小鼠骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病小鼠

目的:构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)及胰岛素融合基因的重组质粒,转染小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察转染融合基因后BMSCs移植治疗糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法:应用重叠延伸PCR技术合成insulin-IRES-EGFP和IRES-EGFP两段序列,分别克隆至逆转录病毒载体pMSCV中,经过包装细胞PT67的包装后转染小鼠BMSCs。荧光显微镜观察转染后EGFP的表达；RT-PCR法检测转染后胰岛素基因的表达。将转染了两种质粒的BMSCs培养后分别植入两组糖尿病模型小鼠体内,观察各组受体鼠血糖及体质量等指标的变化,并以正常对照组小鼠作对照。结果:成功构建重组质粒pMSCV-insulin-IRES-EGFP、pMSCV-IRES-EGFP;倒置荧光显微镜下观察到转染后的BMSCs发出稳定的绿色荧光信号。转染了pMSCV-insulin-IRES-EGFP的BMSCs能稳定表达外源性胰岛素基因,转染后小鼠血糖明显低于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05)；转染后35 d体质量明显高于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05)。结论:重构的insulin-EGFP载体能够起到良好的示踪作用,且EGFP的表达不影响胰岛素基因的表达；转染融合基因的小鼠BMSCs移植治疗糖尿病小鼠可以部分缓解小鼠糖尿病症状。     

人对氧磷酶1基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的：构建带有人对氧磷酶1（hPONI）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体,并检测其转染大鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）后hPON1的表达。方法：提取流产胎儿肝脏的总RNA,RT-PCR获得cDNA,设计引物通过PCR获得PON!基因片段,将其与pGEM—TEasy载体连接,将PON1基因片段切下,插入到质粒pAAV—IRES—GFP的多克隆位点,获得质粒pAAV—PON1-IRES—GFP,经酶切和测序鉴定。包装的病毒rAAV—PON1用斑点杂交检测滴度,并用其转染EPCs检测hPON1在mRNA水平的表达。结果：pAAV—PON1-IRES-GFP酶切和测序结果完全正确。斑点杂交检测病毒的滴度为1．7×10^10g／mL,RT—PCR结果显示病毒转染EPCs后存在hPON1的表达。结论：成功构建了pAAV—PON1-IRES—GFP质粒,包装出较高滴度的rAAV—PON1,并且转染EPCs后可以检测到hPON1表达。     

BrdU标记胎兔骨髓间充质干细胞及对细胞生物学行为影响的体外研究

目的:通过用5-溴脱氧尿苷(5- bromodeoxyuridine,BrdU)标记胎兔骨髓间充质干细胞(bone marrow rnesenchymal stem cells,BMSCs),探讨BrdU作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:取胎兔骨髓组织密度梯度离心法分离培养BMSCs.取P3代细胞以终浓度分别为5,...     

血小板衍生生长因子对骨髓间充质干细胞向成神经细胞分化趋化性迁移的影响

目的初步探讨血小板衍生生长因子（PDGF）对成神经细胞分化不同阶段骨髓间充质干细胞（BMSCs）趋化性迁移的影响。方法密度梯度离心和贴壁培养法分离培养BMSCs,并予以传代。用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和丁羟基茴香醚（BHA）相结合的方法诱导BMSCs向成神经细胞分化,并用特异性标志物进行鉴定,利用Dunn chamber建立体外迁移模型,评估PDGF对不同分化阶段BMSCs定向迁移的影响。结果通过密度梯度离心和贴壁培养法获得了纯化的大鼠BMSCs。诱导组BMSCs变为神经元样细胞,而对照组的BMSCs形态无变化。Dunn chamber分析显示,分化不同阶段的BMSCs对PDGF的趋化程度不同：和对照组相比较,未诱导的BMSCs、预诱导24h和诱导5h的分化细胞的迁移速率得到明显提高（P〈0.05）;而未诱导的BMSCs、维持18h和维持48h的分化细胞的迁移效率明显升高（P〈0.05）。结论 BMSCs可以被诱导分化为神经样细胞;分化不同时期的细胞有不同的迁移能力。     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。