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构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体(uPAR)反义RNA的表达质粒pURAS。方法采用RT-PCR方法扩增并克隆尿激酶受体(uPAR)cDNA5’端-46~454bp一段长500bp的顺序,利用DNA重组技术将该片段反向插入表达载体pcDNA3的CMV启动子下游。结果限制性内切酶分析和DNA顺序分析证实RT-PCR获得的uPARcDNA片段与文献报道相吻合;重组质粒pURAS转染肺癌细胞株95D,NorthernBlot证实转染细胞克隆有uPAR反义RNA的表达。结论重组质粒pURAS能在肺癌细胞株95D中表达尿激酶受体反义RNA,尿激酶受体(uPAR)反义RNA表达质粒的构建获得成功。 相似文献
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建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)的细胞株。将t-pAcDNA连接在真核表达载体pcDNA3的HindⅢ位点,构建成重组质粒pcDNA3tPA,用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,G418筛选培养后形成阳性克隆。结果:培养液中重组t-pA(Recombinantt-pA,rt-pA)活性>6000IU/106细胞d-1.Northern杂交证实t-PAcDNA基因的转录。高表达细胞连续传代10次后,培液中rt-pA活性未见明显变化。结论:转染t-PAcDNA基因的CHO细胞已形成稳定的工程细胞。 相似文献
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尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体(uPAR)反义RNA的表达质粒pURAS。方法 采用RT-PCR方法扩增并克隆尿激酶受体(uPAR)cDNA5’端-46 ̄454bp一段为500bp的顺序,利用DNA重组技术将该片段反向插入表达载体pcDNA3的CMV启动子下游。结果 限制性内切酶分析和DNA顺序分析证实RT-PCR获得uPAR cDNA片段与文献报道相吻合;重组质粒pURAS转染肺癌细 相似文献
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目的:观察丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白DNA疫苗诱导BALB/c小鼠体液免疫应答的效力,为研制应用于人类的HCV DNA疫苗提供实验依据。方法:将全长HCV核心蛋白基因插入真核表达质粒载体pcDNA3.1,构建HCV核心蛋白重组表达质粒pcDNA3.1HCVcore,肌注BALB/c小鼠,以ELISA法检测小鼠血清HCV抗体。以此重组质粒转染小鼠NIH3T3细胞,以HCV抗体阳性小鼠血清为捕获抗 相似文献
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目的:构建带有内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的重组腺病毒载体。方法:将eNOS cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pCA14,得到重组质粒pCA14-CMV-eNOS。采用磷酸钙DNA沉淀法将质粒pCA14-CMV-eNOS与腺病毒拯救质粒pBHG10共转染293细胞,通过同源重组,生成带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(AdCMVeNOS)。eNOScDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。结果:经形态学、病毒DNA酶切、PCR和RT-PCR等方法的鉴定,证实了载体构建的正确性。结论:带有eNOS基因的重组腺病毒载体的成功构建,为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。 相似文献
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目的制备人巨细胞病毒(HCMV)p52蛋白特异性抗原。②方法用PCR技术扩增HCMVp52蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA片段,克隆到表达载体pBV220中,转化E.coliDH5α株,用氨苄青霉素抗性和质粒酶切图谱分析法筛选阳性克隆,经温控诱导其表达。③结果重组克隆能有效表达天然蛋白p52,ELISA检测重组p52蛋白具良好的抗原特异性。④结论通过基因工程制备的重组p52蛋白可作为HCMV血清学诊断的良好抗原。 相似文献
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丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及表达 总被引:6,自引:4,他引:2
目的:构建能同时表达丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段的融合基因真核表达载体pcDNA3 HCV C-Fe,为下一步修饰和转染树突状细胞,制备能高效表达HCV C和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备。方法:用分别含有Xhol I和Xba I初位点的人免疫球蛋白(IgG)Fc区基因上、下游引物,以含有人IgG基因序列的质粒pCMVsFc为模板,通过PCR扩增获得Fc区基因片段,基因片段回收后,以Xhol I和Xba I双酶切,定向插入到含HCV C基因的质粒PcDNA3 HCV C下游双粘端位点之间,获得重组表达质粒pcDNA3 HCVFc。通过酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。以抗HCV C和抗Fc单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测pcDNA3 HCV-Fc在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果:酶切、PCR及测定鉴定证实,pcDNA3 HCV—Fc插入片段为Fc区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论:构建的质粒pcDNA3 HCV—Fc可以在7721细胞中瞬时表达Fc基因,为研究HCV C—Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础。 相似文献
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目的:克隆大鼠促凋亡基因Smac,构建真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac,并在心肌细胞中表达。方法:应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠肾组织中扩增到大鼠Smac基因的CDs片段,构建含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac并将此重组质粒、空载体pcDNA3.1+、pcDNA3.1+-EGFP通过脂质体介导转染大鼠心肌细胞H9C2,荧光显微镜、流式细胞术间接检测转染效率,RT-PCR法检测外源基因的表达。结果:经测序目的基因序列与GenBank(NM_001008292)公布的结果一致,所构建的重组质粒pcDNA3.1+-rSmac经PCR和酶切鉴定所释放的片段大小与预期结果相符。荧光显微镜和流式细胞术检测,细胞转染有效,转染效率达38.36%。转染重组载体pcDNA3.1+-rSmac 48 h后,H9C2细胞Smac的mRNA水平明显升高。其中,对照组Smac/β-actin为1.19,空载体组Smac/β-actin为1.31,二者之间差异无显著性(P>0.05);转染pcDNA3.1+-rSmac组Smac/β-actin为1.67,与对照组比较差异具有显著性(P<0.01)。结论:克隆大鼠Smac基因成功,成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac,并在转染后的心肌细胞中表达,为研究Smac基因在心肌细胞凋亡过程中的调控作用奠定基础。 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法:扩增HCV NS5A基因,构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3.1(-)—NS5A;并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达;与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果:质粒pcDNA3.1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白,共转染实验中pcDNA3.1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3.8倍。结论:构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白,并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因,深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。 相似文献
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目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA,构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA,采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段,并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒,双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1.1kb的产物,连接重组后经双酶切筛选阳性克隆,DNA测序验证,确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体,为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。 相似文献
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hVEGF165和嵌合水蛭肽融合基因的真核表达载体的构建及其表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:克隆hVEGF165和嵌合水蛭肽(fused hirudin,FH)融合基因,构建hVEGF165-FH/pcDNA3.0基因表达载体,并在人内皮细胞株中表达.方法:分别通过PCR法扩增hVEGF165和引物退火法合成FH基因,将融合基因插入表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0.对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析,将正确克隆的质粒分别作体外快速转录翻译鉴定,以及经脂质体介导转染人内皮细胞株,并对表达产物进行鉴定.结果:hVEGF165和FH成功融合,形成711 bp的目的片段,并成功构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0,重组质粒转染人内皮细胞株有hVEGF165-FH表达.结论:重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0在人内皮细胞株中得到表达,为其融合蛋白活性研究及基因治疗打下良好基础. 相似文献
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血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达 总被引:4,自引:2,他引:2
目的:本实验试图构建具有生物学活性的VEGF真核表达载体,为VEGF基因治疗提供载体。方法:将已获得的hVEGF165 cDNA克隆到GST融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达,Western blot鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体pcDNA3 /hVEGF165,脂质体介导转染CHO-K1细胞,G-418筛选,Northern blot,West-ern blot分别检测其在细胞内的转录和表达情况,3H-TdR掺入法检测表达蛋白的活性。结果:实验组的Northern blot和Western blot出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞3H-TdR掺入率明显高于对照组(P< 0.001)。结论:本实验所构建的VEGF真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。 相似文献
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目的:建立截短的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达:方法:应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆人真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过脂质体转染至CHO细胞。结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1-Ct,成功转染CHO细胞,间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3.1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论:成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体,瞬时转染CHO细胞,为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗(BCG)活载体疫苗奠定基础。 相似文献
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目的 构建stathmin基因真核表达载体,研究上调stathmin基因表达对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用RT-PCR扩增stathmin cDNA,克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.重组载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株.显微镜观察转染细胞形态学变化,Western印迹法检测转染细胞stathmin蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠移植瘤实验研究转染细胞的成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pcDNA3.1(+)载体,获得pcDNA3.1-stathmin重组表达载体.Western印迹法证实重组载体上调EC9706细胞stathmin蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.01).与对照组细胞比较,pcDNA3.1-stathmin转染细胞形态变大、多核、有丝分裂障碍;pcDNA3.1-stathmin转染细胞倍增时间延长(25~28 h)、增殖活性降低、细胞克隆形成率下降(34.5%±6.9%),细胞分裂阻滞于G2/M期(21.7%±3.4%),裸鼠体内致瘤性降低,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3.1-stathmin上调stathmin基因表达能够抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖和致瘤性,stathmin可能成为食管鳞癌患者治疗的理想靶点. 相似文献
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DNAvaccine,alsocallednucleicacidvaccine,isarecombinanteukatyoticexpressionplasmidencodingcertainantigenofpathogen.DNAvaccinecanexpressantigenandinducecellularandhumoralimmuneresponsesaftervaccinationbyintramuscularinjectionorplasmid--coatedmicroparticlebombardment.Itshightemperaturestability,lowexpenseofmassproductionandtheabilitytoinducestrongimmuneresponsesevenfortheuseintherapyhavemadeDNAvaccineanexcitingwayfornewvaccinedevelopment['J.InordertofurnishevidenceforHCVDNAvaccinesuitablefo… 相似文献