人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

稳定表达肌肉型乙酰胆碱受体的细胞株建立和鉴定

目的:建立稳定表达骨骼肌细胞乙酰胆碱受体(AChR)的人胚肾(HEK293)细胞系,进行各种药理学研究.方法:将编码小鼠m-nAChR的α、β、γ、δ和ε亚基的cDNA分别重组于真核细胞表达质粒pcDNA3.1,用脂质体转染技术将重组质粒导入HEK293细胞,使其细胞膜上分别表达胚胎型乙酰胆碱受体(γ-nAChR)和成年型乙酰胆碱受体(ε-nAChR).用G418和免疫荧光技术筛选出稳定表达两种受体亚型的细胞株. 结果:在G418反复筛选后的HEK293细胞系中,有14株明显表达ε-nAchR;4株明显表达γ-nAchR,受体大部分表达于细胞膜上. 结论:用重组后的pcDNA3.1转染HEK293细胞,经筛选后可以稳定表达m-nAChR.     

稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建能稳定表达HIV-1 GagPol基因的真核表达载体.方法:用PCB方法扩增HIV-1 GagPol基因,克隆入pMD18-T,然后亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.2(一)中,将构建的重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol分别瞬时和稳定转染HEK293细胞,经G418筛选,建立稳定转染GagPol基因的细胞系,并应用Western Blot方法鉴定表达产物.结果:酶切鉴定和Western Blot检测证实重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol构建正确,并能稳定表达HIV-1GagPol蛋白.结论:成功构建携带HIV-1 GagPol基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/GagPol,并在HEK293细胞中获得稳定表达.     

人PD-L1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的稳定转染

目的构建含有人PD-L1基因的真核表达载体,并通过稳定转染获得稳定表达PD-L1分子的HEK293细胞系。方法从人心脏cDNA文库中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（Xho1和EcoR1）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定高表达PD-L1分子的HEK293细胞系,通过流式细胞术、RT-PCR及Westernblot分析PD-L1的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1,建立了稳定转染PD-L1目的基因的HEK293细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定转染该分子的HEK293细胞系。     

稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞系的建立

目的:建立稳定表达GFP-LC3的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系.方法:构建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表达载体,应用转染技术将该质粒导入RAW264.7细胞,用G418筛选稳定表达的细胞系.真核细胞中GFP-LC3的表达分别用荧光显微镜与Western blot方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察内质网应激时细胞发生自噬的情况.结果:成功获得2株转染并经G418反复筛选的RAW264.7细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光的表达率在95%以上,Western blot结果证实了GFP-LC3融合蛋白的表达.激光共聚焦显微镜和Western blot均证明内质网应激可以诱导自噬的发生.结论:用peDNA3.1-GFP-LC3转染的RAW264.7细胞经G418筛选,可成功建立GFP-LC3稳定表达系,从而为后续功能实验提供有用的细胞研究模型. ern blot方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察内质网应激时细胞发生自噬的情况.结果:成功获得2株转染并经G418反复筛选的RAW264.7细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光的表达率在95%以上,Western blot结果证实了GFP-L 3融合蛋白的表达.激光共聚焦显微镜和Western blot均证明内质网应激可以诱导自噬的发生.结论:用peDNA3.1-GFP-LC3转染的RAW264.7细胞经G418筛选,可成功建立GFP-LC3稳定表达系,从而为后续功能实验提供有用的细胞研究模型.     

高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡

目的:构建人c-Jun氨基末端激酶3(JNK3)真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定表达细胞系;以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡关系.方法:以pD-BLeu-JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体peDNA3.1/myc-His B,经PCR和酶切鉴定,DNA测序正确,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定表达细胞系.RT-PCR,Western Blot检测携带Myc标签的JNK3融合蛋白的表达,流式检测表阿霉素对稳定表达JNK3基因的HEK293细胞的促凋亡作用.结果:成功构建了pcDNA3.1-JNK3真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定表达细胞系,成功地表达目的基因;与对照细胞相比表阿霉素能明显促进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡.结论:JNK3稳定表达细胞系的建立和高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡,为进一步研究JNK3的功能提供了良好的实验基础.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

稳定高效表达正反义Alu-Sx细胞系的建立

目的建立稳定高效表达正反义Alu-Sx的细胞系.方法根据Alu亚家族Sx序列合成两对两端带有限制性酶切位点的引物,提取HEK293细胞的总DNA后PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中构建成重组体.经酶切及测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染HEK293细胞后G418筛选稳定表达的细胞克隆,Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果成功构建Alu亚家族Sx的正反义真核表达载体并获得高效稳定表达的HEK293细胞亚克隆.结论高效稳定表达正反义Alu Sx的HEK293细胞亚克隆可用于下一步研究.     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切,经T4DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+)中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL及空质粒pcDNA3.1(+)分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高于空质粒pcDNA3.1(+)转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

乙酰胆碱受体四聚体前体α亚单位在人胚肾293细胞膜上的表达

[目的]将乙酰胆碱受体四聚体前体!亚单位重组质粒(pcDNA3.1-AchRα-BirA)转染至人胚肾293(HEK293)细胞,并在其细胞膜上获得稳定表达.[方法]提取重组质粒pcDNA3.1-AchRα-BirA,经限制性核酸内切酶Eco RⅤ单酶切后,行低熔点琼脂糖凝胶电泳检测.采用脂质体转染法,将pcDNA3.1-AchRα-BirA转染至HEK293细胞,经抗生素G418筛选后形成集落状抗性克隆细胞.将表达产物扩大培养,应用免疫荧光技术,以异硫氰酸荧光素标记,经荧光显微镜查看表达情况.[结果]电泳检查发现了大小约为6.964 kb的条带.转染后G418筛选获得抗性克隆细胞,经荧光显微镜观察到HEK293细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功地将AchRα-BirA基因转染至HEK293细胞膜上且有表达,为下一步构建AchRα四聚体奠定了基础.     

稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系的建立

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,转染SHG-44细胞,建立稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系.方法:PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段.用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1( ),构建真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果:扩增出MCHR2的全长cDNA)成功构建pcDNA3.1( )MCHR2;RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测到MCHR2的表达,提示成功建立了稳定、高表达MCHR2的SHG-44细胞株.结论:MCHR2-SHG-44细胞株的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定了良好的实验基础.     

rAQP4-M1真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的 构建rAQP4-M1基因真核表达载体,建立稳定转染AQP4-M1的CHO细胞系.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织中扩增rAQP4-M1,并将PCR产物双酶切后插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经过菌落PCR、双酶切及测序验证的pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1质粒通过脂质体转染CHO细胞.G418筛选建立稳定转染rAQP4-M1的CHO细胞系.采用细胞免疫荧光和免疫印迹技术检测rAQP4-M1在该细胞系中的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.免疫荧光检测结果显示,rAQP4-M1在CHO细胞膜上稳定表达;免疫印迹检测可见34×103处的阳性条带,表明rAQP4-M1在该细胞系中成功表达.蓝绿温和胶电泳技术证实了rAQP4-M23而不是rAQP4-M1参与了正交排列颗粒(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形成.结论 rAQP4-M1在CHO细胞系中稳定表达成功,rAQP4-M1未参与OAPs的形成.     

稳定表达AT1R基因且分泌Aβ的HEK293细胞株构建

目的: 用人血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)基因转染表达人Aβ前体蛋白(APP)及早老素蛋白1(PS1)的人胚肾293(APP-PS1-HEK293)细胞,建立稳定转染细胞系?方法:利用真核表达载体pcDNA3.1-AT1R以阳离子脂质体法转染APP-PS1-HEK293细胞,pcDNA3.1-EGFP为阴性对照,通过G418(600 μg/ml)选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR?细胞免疫荧光及Western blot检测转染的AT1R的表达?结果:pcDNA3.1-AT1R稳定转入APP-PS1-HEK293细胞,稳定成功表达目的基因?结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究AT1R对Aβ分泌的影响及其在阿尔茨海默病发病机制探讨中提供了良好实验基础?     

小鼠重组釉蛋白基因稳定表达细胞系的建立

目的:构建小鼠重组釉蛋白基因的真核表达系统,并建立稳定表达该蛋白的细胞系.方法:取初生小鼠牙胚组织,提取 RNA,用 RT-PCR 技术扩增釉蛋白基因片段,经双酶切后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1^TM/myc-His(-)B 上, 转化大肠杆菌E.coli DH5α, 中提质粒,将该重组表达质粒转染至 HEK 293A 细胞,用 G418 筛选出阳性克隆,并检测釉蛋白的表达水平.结果:通过测序表明,小鼠釉蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上.将该表达系统转染 HEK 293A 细胞后,进行 Western Blot 检测,证明其中有相对分子质量约 32 000 的釉蛋白表达.结论:成功构建了小鼠重组釉蛋白真核表达载体,建立了稳定细胞系,为获得高纯度的釉蛋白,为进一步研究蛋白质功能奠定了基础.     

稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的 构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的cDNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORα cDNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pcDNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的cDNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORα mRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

重组GSTP1真核表达质粒的构建及稳定转染NCI-H520细胞系的建立

目的构建pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞N C I-H 520中,建立稳定转染的N C I-H 520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以pD N R-LIB-G STP1为模板,用PC R扩增G STP1 cD N A的编码区,并将扩增的cD N A片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pcD N A3.1(+)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系N C I-H 520,经G 418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用W estern blotting检测转染前后该细胞株G STP1基因在蛋白水平的表达。结果 pcD N A3.1(+)/G STP1经酶切鉴定及D N A测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经W estern blotting检测,重组质粒转染株中G STP1基因的蛋白表达水平明显高于对照组,证实G STP1基因已稳定转染到N C I-H 520细胞中并得到表达。结论成功构建了pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达质粒,建立了稳定表达G STP1的N C I-H 520细胞系,为进一步研究G STP1的生物学功能奠定了基础。     

成纤维细胞生长因子受体FGFR1真核表达质粒的构建及其在HEK293T细胞的表达

目的建立一个有效表达FGFR1的真核系统。方法从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到FGFR1基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构建成pcDNA3.1-FGFR1质粒表达载体,并在HEK293T细胞重组表达;将pcDNA3.1-FGFR1质粒转染HEK293T细胞,通过免疫印迹和免疫荧光检测FGFR1在细胞中的表达情况。结果扩增的FGFR1序列与数据库一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了FGFR1c DNA在HEK293T细胞膜上的表达。结论成功扩增出FGFR1 c DNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了FGFR1在HEK293T细胞的高效表达。     

pNTAP-MK2真核表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

目的 构建pNTAP-MK2真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系.方法 将MK2亚克隆至串联亲和纯化载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-MK2,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用脂质体PolyFect介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-MK2融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-MK2的表达及细胞内定位情况.结果 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-MK2主要分布在核内.结论 成功构建pNTAP-MK2真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对MK2定位产生明显影响.     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。