pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒重组体构建

目的 构建大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒介导的表达载体。方法 提取大鼠脑组织总RNA．用逆转录PCR扩增DNA多聚酶β（POLB）的编码区，与T载体连接，作DNA测序后，酶切POLB基因并连入腺病毒穿梭质粒pAdTraek-CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。酶切鉴定，重组腺病毒质粒（pAd-polb）Lipofectamine2000转染293细胞，用293细胞扩增重组腺病毒。结果 8个TA克隆中有2个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLB cDNA序列完全一致。DNA序列正确的POLB重组腺病毒质粒Ad-polb转染293细胞后，荧光显微镜下可见绿色荧光。结论 用TA克隆和AdEasy系统，成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体。     

人Toll样受体2细胞外区基因重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的:克隆人Toll样受体2(TLR2)细胞外区基因,并构建含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-TLR2. 方法:应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2细胞外区基因,克隆入pUCm-T载体并转化大肠埃希菌感受态DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序分析后,用KpnⅠ和HindⅢ双酶切,将目的片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,双酶切鉴定并测序验证. 结果:RT-PCR扩增得到约1 000bp的目的基因片段,TA克隆后测序鉴定与GenBank中的序列一致,经酶切连接成功地将目的基因插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中. 结论:成功克隆了人TLR2细胞外区基因,并构建了含目的基因的重组腺病毒穿梭载体.     

人CyPA基因重组质粒pET30α(+)-CyPA的构建及鉴定

目的:构建人CyPA基因重组质粒pET30α(+)-CyPA.方法:根据CyPA基因设计引物,从人肺痛组织eDNA中扩增目的基因.pET30α(+)质粒、目的基因DNA经Nde I酶、Xho I酶双酶切,用DNA快速连接试剂盒连接得重组子pET30α(+)-CyPA.将重组子转化DH5α,经卡那霉素琼脂糖平板筛选,挑选阳性克隆进行PCR扩增并测序.结果与结论:快速PCR能从阳性克隆中扩增出目的DNA.将重组质粒测序,由起始密码ATG到终止密码TAG止,扩增得到的目的基因片段具有完整的阅读框;与人CyPA基因cDNA序列进行比较,同源性达到99.8%.重组质粒pET30α(+)-CyPA构建成功.     

人端粒酶逆转录酶核心启动子的克隆

目的克隆出人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子,为构建hTERT核心启动子调控的重组腺病毒提供实验基础。方法提取肝癌细胞HepG2基因组DNA作为模板,进行PCR扩增,扩增产物酶切后亚克隆至pcDNA3.1（＋）质粒。对重组体进行酶切和测序鉴定。结果PCR扩增出约250 bp的目的片段,经酶切和测序鉴定表明质粒构建成功。结论hTERT核心启动子的成功克隆,为进一步实验提供了基础。     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

小鼠线粒体ATP8基因RNA干扰载体构建

目的:构建ATP合成酶亚基8(ATP8) 基因的RNA干扰载体.方法:应用小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)法表达构建ATP8的RNA干扰载体,重组质粒经BamH I和EcoR I酶切鉴定;选择其中单个克隆进行单向测序鉴定.结果:重组质粒DNA能被BamH I切开而不能被EcoR I酶切,所提质粒为阳性重组载体;测序鉴定结果与设计的shRNA完全一致.结论:成功构建了pGPH1/GFP/ Neo-mouse-shATP8 RNA干扰质粒,为下一步进行ATP8基因RNA干扰在卵母细胞发育成熟中的作用奠定基础.     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。     

介导人血红素加氧酶-1基因的重组腺相关病毒载体的构建

目的:构建含人血红素加氧酶-1(hHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体并进行鉴定。方法:利用基因重组技术,采用限制性内切酶HindⅢ从质粒XM-6/hHO-1中将目的基因hHO-1基因片段切出,克隆到质粒PAAV-MCS的HindⅢ位点中,构建重组质粒pAAV-hHO-1,采用限制性内切酶酶切,PCR和DNA测序鉴定。结果:PCR扩增出1 317 bp大小的片段,酶切鉴定证实插入位点及方向与预期的完全一致;测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致。结论:成功构建了含hHO-1基因的重组腺相关病毒载体,为缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定

目的　构建人肝细胞生长因子 (hHGF)的原核表达载体。方法　利用基因重组技术 ,将人肝细胞生长因子cDNA全长序列 ,定向克隆于表达型载体PUC18质粒的多克隆位点中 ,限制性内切酶酶切鉴定。结果　重组PUC18-HGF原核表达载体经限制性内切酶电泳分析 ,与理论值相符。结论　本实验成功将人肝细胞生长因子cDNA全长序列插入表达型载体PUC18多克隆位点BamHI和Xbal限制性内切酶位点之间 ,为通过基因工程获得外源性HGF提供实验依据     

细胞因子IL-18基因对Ag85A DNA疫苗诱导产生抗体水平的影响

目的 :研究表达含白介素 (IL) 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (MTB)H37Rv Ag85A基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆真核表达载体pcDNA3.1的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将分别表达人IL 18基因的真核表达质粒pcIL18与MTBpcAg85A基因疫苗联合肌注免疫BALB c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2周。每次免疫后 2周采血 ,分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗Ag85A抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBCs的RNA中扩增IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。联合应用pcIL18,三次免疫后血清抗Ag85A抗体的滴度明显较单独应用pcAg85A增高。结论 :pcIL18与pcAg85A基因疫苗联合免疫 ,可显著增强Ag85A抗原的特异性体液免疫应答。pcIL18+pcAg85A基因联合免疫是否具有增强Ag85A抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

人钙调磷酸酶-B真核表达质粒的构建

目的 为研究钙振荡现象,构建人钙调磷酸酶-B(CNB)基因的真核表达质粒.方法 采用RT-PCR技术,从MCF-7细胞中扩增出人CNB基因序列;利用分子克隆技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.0中,并进行酶切鉴定和DNA测序.结果 琼脂糖凝胶电泳分析显示RT-PCR产物为预期分子量大小,酶切鉴定图谱正确,DNA测序结果经核实完全符合.结论 成功构建人CNB基因的真核表达质粒,为进一步研究钙振荡现象打下了基础.     

弓形虫重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18的构建及鉴定

目的 构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18 DNA重组质粒,并对其进行克隆及鉴定。方法 采用PCR法对目的基因进行扩增,构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,转染至人包皮成纤维细胞（HFF）进行表达并用SDS-PAGE和β-actin进行鉴定。 结果 经测序、双酶切和PCR鉴定,重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18构建正确;经RT-PCR和SDS-PAGE鉴定, AMA1、ROP18基因均在哺乳动物细胞中正确转录与表达。结论 成功构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,并可在HFF细胞中稳定表达。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。     

人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立

目的：建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法：提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pMD-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒。提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR GreenⅠ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线。结果：人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论：建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验。     

构建人类neuritin真核表达系统

目的：构建人类neuritin基因真核表达载体，并观察其转染的PC12细胞中neuritin的表达。方法：用基因重组技术，将人类Neuritin cDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDN A4．0中，经酶切鉴定及测序分析、并以脂质体介导转染PC12细胞，了解其在细胞内的表达。结果：酶切鉴定及测序分析，表明重组pcDNA4．0-neuritin表达质粒克隆成功．neuritin基因在PC12细胞中获得表达。结论：以脂质体介导pcDNA4．0-neuritin质粒转染真核细胞，为基因治疗神经系统退行性病变奠定实验基础。     

人中性粒细胞多肽1,3真核表达载体的构建与鉴定

目的：扩增人中性粒细胞多肽1，3(HNP1，3)基因片段，构建真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3。方法：从健康人中性粒细胞中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出HNP1，3基因完整的cDNA片段，应用TA克隆插入pMD18-T载体，经酶切鉴定及序列分析确证后，将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中。结果：从人中性粒细胞中克隆出人HNPl1，3基因，经测序分析与GenBank公布的人HNP1，3核苷酸序列同源性为100％，成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3。结论：真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3的成功构建，为后续重组基因的真核／表达及其对HIV-1抑制作用的研究奠定了实验基础。     

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组，得Omp25基因片段，T—A克隆后测定核苷酸序列，将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切和DNA测序测定，将构建的重组质粒转化大肠杆菌（E．coli HB101，TOP10），经IPTG诱导后，用SDS—PAGE检测重组蛋白rOrap25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确，成功构建了重组质粒DGEX-4T-1-Omp25，经IPTG诱导，特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段，并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。