B组柯萨奇病毒诱导的细胞焦亡在心肌损伤中的作用

目的利用caspase-1抑制剂抑制焦亡,评价细胞焦亡在B组柯萨奇病毒（Coxsackievirus B,CVB）所致心肌损伤中的作用,确定CVB能否通过诱导细胞焦亡导致心肌炎症。方法Balb/c乳鼠分为四组：对照组、CVB3感染组（腹腔注射CVB3）、1次抑制剂组（CVB3感染乳鼠后注射1次caspase-1抑制剂）和3次抑制剂组（CVB3感染乳鼠后在1、3、5天分3次注射caspase-1抑制剂）,Western blot检测各组乳鼠心肌组织中的caspase-1表达,HE染色观察各组乳鼠心肌组织病理变化。HeLa细胞分为8组,前4组用CVB3感染不同时间,后4组CVB3感染的同时分别加入不同剂量caspase-1抑制剂,检测CVB3病毒蛋白表达量。结果CVB3感染组的乳鼠心肌组织中激活的caspase-1含量增加,与CVB3组相比,注射caspase-1抑制剂的小鼠心肌组织中激活的caspase-1含量明显减少。正常对照组乳鼠心肌细胞组织状态正常,CVB3感染组乳鼠心肌组织大面积变性、坏死,CVB3＋caspase-1抑制剂组乳鼠心肌组织发生病理变化但程度较轻。HeLa细胞中caspase-1与CVB3蛋白含量随caspase-1抑制剂剂量增大而降低。结论抑制细胞焦亡可有效减轻CVB3所致心肌损伤,CVB诱导的焦亡参与心肌致病过程。     

肠道病毒性脑膜炎基因诊断的研究

肠道病毒（ＥＶＳ）感染是无菌性脑膜炎和脑炎常见的病因之一，由于其临床表现及脑脊液（ＣＳＦ）检查无特异性，故临床难与其它细菌性或病毒性感染相鉴别。本文用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测了临床诊断的２４例病毒性脑膜炎及２０例其它神经疾病（ＯＮＤ）对照组患者的ＣＳＦ中ＥＶｓ－ＲＮＡ。所用的引物选自ＥＶｓ基因组中高度保守的５＇－非编码区（５＇－ＮＣＲ），这些引物已被证明能够检测出ＥＶｓ广泛的型别。结果在２４例病毒性脑膜炎患者ＣＳＦ中检出ＥＶｓ－ＲＮＡ阳性者７例，而对照组全部阴性。提示经ＲＴ－ＰＣＲ的早期诊断有助于对ＥＶｓ脑膜炎采取早期特异的抗病毒治疗。     

柯萨奇B1病毒VP1基因DNA免疫的研究

目的：构建柯萨奇B1病毒（CVB1）的DNA疫苗，评价其免疫学性状。方法：将重组质粒pMD18-T-VPI中的CVB1 VP1基因亚克隆至pCEP4载体,构建真核表达系统pCEP4－VP1作为DNA疫苗，经酶切、PCR和测序后鉴定后转染至HeLa细胞，用间接免疫荧光法检测CVB1抗原的体外表达。提纯制备pCEP4－VP1接种BALB／C小鼠，取血清用ELISA法检测抗CVB1IgM和IgG，用^51Cr释放法测定CTL反应。结果：酶切、PCR和测序证明了VP1 DNA疫苗构建正确，转染pCEP4－VP1的HeLa细胞中可见到荧光标记，提示表达了VP1蛋白，接种pCEP4－VP1的小鼠可检测到抗CVB1的IgM的IgM和IgG，并能产生较强的特异性CTL反应。结论：pCEP4-VP1可作为DNA疫苗诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答。     

柯萨奇病毒B组3型2B蛋白诱导细胞自噬及其基序鉴定

目的 探讨柯萨奇病毒B组3型(CVB3) woodruff病毒2B蛋白对细胞自噬的诱导作用,及其自噬相关基序的鉴定.方法 分别构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与CVB3 woodruff病毒2B蛋白及其9种截短蛋白的融合蛋白(EGFP-2B、EGFP-2B1-249、EGFP-2B1-201、EGFP-2B1-153、EGFP-2B1-105、EGFP-2B1-57、EGFP-2B106.201、EGFP-2B106-249、EGFP-2 B205-297、EGFP-2B106-201)真核表达载体,红色荧光蛋白(mCherry)与微管相关蛋白轻链3(LC3)的融合蛋白真核表达载体pmCherry-LC3;应用激光共聚焦与蛋白质免疫印迹(Western blot)检测病毒2B蛋白对宫颈癌细胞(HeLa) LC3表达的影响;荧光显微镜观察9种截短蛋白在HeLa细胞中的表达;Western blot检测pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后LC3的表达;观察自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-MA)处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249诱导细胞自噬的情况.结果 CVB3攻击HeLa细胞后,mCherry-LC3呈现细胞核周点状聚集表达,Western blot检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;pEGFP-2B与pmCherry-LC3共转染后也可见细胞核周围绿色荧光与红色荧光均成点状聚集并相互重叠,且LC3-Ⅱ条带明显;9种截短融合蛋白质粒分别转染HeLa细胞后,其中可见细胞核周围绿色荧光点状聚集的最短截短蛋白为EGFP-2B106-249;pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后可检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;3-MA处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249分别与pmCherry-LC3共转染的细胞均未见绿色和红色荧光的核周点状聚集.结论 CVB3 woodruff病毒2B蛋白可以诱导宿主细胞发生自噬,其中截短蛋白2B106-249是病毒蛋白2B诱导HeLa细胞发生自噬的功能基序.     

IL-12基因联合吡柔比星治疗裸鼠膀胱癌移植瘤的实验

 目的 探讨联合应用白细胞介素12(IL-12)质粒和吡柔比星（THP）对人膀胱癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 将人EJ膀胱癌细胞株裸鼠腋下接种，成瘤后设4组（每组6只）：联合组于骨骼肌注射IL-12真核表达质粒pcAGGS-mIL-12和腹腔注射THP;IL-12组骨骼肌注射pcAGGS-mIL-12;THP组腹腔注射THP;对照组肌肉及腹腔注射0.9%氯化钠溶液，以上注射每周2次，共4次。观察各组裸鼠肿瘤大小变化。4周后处死荷瘤鼠。免疫组织化学法检测肿瘤内VEGF 表达。ELISA法测定血液及肿瘤组织中IL-12和γ-干扰素(IFN-γ)的表达。结果 联合组肿瘤生长明显抑制，瘤重及体积明显小于其他组。ELISA法表明IL-12组和联合组 IL-12和IFN-γ都高表达。免疫组织化学法表明联合组VEGF基因表达量明显低于其他组（P<0.05）。结论 联合应用IL-12真核表达质粒pCAGGS-mIL-12和THP，对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用明显强于单独应用IL-12和THP。     

学导式教学在医学微生物学实验教学中的应用

学导式教学法是在教师指导下学生自学教材、讨论交流、练习巩固,达到牢固掌握知识技能、培养自学能力和自学习惯的教学模式。从医学微生物学实验教学特点和七年制学生的实际出发,概括了医学微生物学实验学导式教学法的实际应用,培养和提高了学生自学能力和综合分析能力。     

5'非编码区嘧啶富集区变异对B组柯萨奇病毒1型毒力的影响

目的 观察5'非编码区(5'UTR)嘧啶富集区变异对B组柯萨奇病毒1型(CVB1)毒力和致病性的影响.方法 定点诱变将CVB1基因组5'UTR第563～573碱基嘧啶富集区5个嘧啶置换为嘌呤,获得突变株CVB1/m563-573.空斑纯化病毒后,利用细胞病变效应(CPE)试验、空斑形成试验、一步生长曲线和半数致死量(LD50)等方法比较CVB1/m563-573与其原型株CVB1/wt的毒力.结果 测序结果显示,CVB1/m563-573的5'UTR嘧啶富集区发生C565A、U567C、U568A、U570A、U572G突变,与预期一致.CPE试验表明,CVB1/m563-573的感染性较CVB1/wt稍弱(A 490分别为0.710±0.074、0.812±0.092),但差异无统计学意义(t=-2.204,P>0.05).空斑形成试验显示,46、58 h时间点CVB1/m563-573形成空斑的数量为(6.40±1.52)×103、(11.60±2.19)×103 pfu(空斑形成单位)/L,直径为(2.00±0.35)、(2.47±0.41)mm,CVB1/wt的空斑数量为(8.40±2.51)×103、(11.80±1.92)×103 pfu/L,直径为(1.80±0.27)、(2.85±0.44)mm,二者比较差异无统计学意义(t值分别为8.000、0.985、10.000、9.000,P均>0.05).一步生长曲线法显示,经过3、5、7 h的扩增,CVB1/m563-573所得的活病毒颗粒数(×103 pfu/L)的常用对数(lg)分别为2.10±0.09、4.28±0.03、7.44±0;CVB1/wt的活病毒颗粒数(×103 pfu/L)的lg值分别为2.80±0.02、4.77±0.02、8.55±0.01.CVB1/m563-573株在3个时间点均较CVB1/wt复制显著慢(t值分别为-13.151、-24.319、-47.714,P均<0.01).CVB1/m563-573和CVB1/wt的LD50分别为3.10×109、1.26×107 pfu/L,CVB1/m563-573致病力较CVB1/wt明显减弱.结论 减少5'UTR嘧啶富集区的嘧啶碱基数量可致CVB1的感染和毒力减弱,该位点突变可能是研发CVB减毒活疫苗的策略之一.     

低硒小鼠模型的建立及低硒对心肌的影响

目的建立低硒实验动物模型,观察低硒对心肌的影响。方法利用黑龙江地产酵母配制低硒小鼠饲料,使用配制的小鼠饲料喂养BALB/c幼鼠,经过4个月的喂养,测定血清、肝脏、心肌细胞的硒含量,观察心肌超微结构的变化,测定血清心肌酶的变化。结果利用黑龙江地产酵母配制的低硒饲料,硒含量为0.016 mg/kg,符合低硒标准。BALB/c鼠用该饲料喂养4个月,心肌、肝脏、血清硒含量分别为0.187 mg/kg、0.219 mg/kg、0.241mg/kg,符合低硒诊断标准。观察低硒鼠心肌超微结构,可见心肌细胞线粒体肿胀,细胞核出现了异型性,血清心肌酶较常硒鼠升高。结论利用黑龙江地产酵母成功配制了低硒饲料。经过低硒饲料饲养可建立低硒鼠模型。低硒可以引起BALB/c鼠心肌细胞损伤。     

抗肠道病毒71型感染药物的研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)的主要病原体,临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹及中枢神经系统并发症[1].5岁以下的儿童感染后易发生严重的并发症,如无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心肌炎和肺水肿等,这些并发症可导致死亡或永久性麻痹[2].至今,在全球许多国家发生了EV71感染的暴发,造成病例大量死亡[3-4].目前对于EV71感染既无有效的疫苗,也无明确有效的抗病毒药物[5-6].该病毒的复制周期包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配与释放,这些过程都可能成为抗病毒药物设计的靶点,按照作用的靶点不同将目前研究的抗EV71药物分为以下几个方面进行综述.     

基础医学创新课程体系下的教学管理模式改革

哈尔滨医科大学参照世界医学教育联合会制定的医学教育标准,借鉴美国、日本等国家的先进课程体系进行创新课程体系教学改革,改革涵盖基础医学课程教学、创新研究型教学以及教学管理.其中教学管理改革从教学准备、课程实施、考核评价等方面全面推陈出新,以保障创新课程体系的运行,教学管理改革的顺利进行有力地支撑了创新课程体系的顺利实施.