脱细胞真皮联合骨髓间充质干细胞修复糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面的研究

目的研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞、脱细胞真皮为支架的组织工程皮肤对糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面愈合的影响。方法 36只大鼠随机分为3组,A组：骨髓间充质干细胞＋脱细胞真皮实验组;B组：脱细胞真皮对照组;C组：空白对照组。观察创面愈合及5-BrdU阳性细胞表达角蛋白的表达情况。结果 A组第3、5、7及14 d创面愈合率分别为（19.10%±3.52%）、（29.80%±4.10%）、（56.71%±8.07%）与（88.12%±5.31%）,明显快于B、C两组（P〈0.05）。A组新生皮肤的细胞结合有序,排列紧密,真皮层较厚,有大量皮肤附属器及血管形成,明显多于B、C两组。免疫组化检测BrdU阳性细胞表达角蛋白。结论骨髓间充质干细胞联合ADM可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。     

小鼠皮肤创伤后创面局部真皮干细胞参与修复过程

目的 研究小鼠皮肤创伤后,创面局部的真皮干细胞是否被激活并参与创伤愈合过程.方法 小鼠背部行全层皮肤损伤后,首先应用腹腔单次注射BrdU 2 h后标记快速分裂细胞(rapidly dividing cells,RDCs),检测创面局部组织中不同时间点细胞增殖反应情况;其次通过多次连续注射BrdU长时间后在体检测标记存留细胞(label-retaining cells,LRCs),以反映创伤后局部真皮干细胞被激活情况;最后分离BrdU在体多次连续标记后的肉芽组织细胞和正常真皮细胞,通过比较其集落形成能力并检测BrdU信号存留情况,研究肉芽组织中真皮干细胞被激活和参与修复的情况.结果 单次注射BrdU 2 h后,在正常皮肤组织中,仅在表皮基底层和毛囊上皮细胞中存在少量的BrdU阳性细胞,而创伤后在创缘表皮、毛囊、创缘真皮和肉芽组织细胞都发生了明显的增殖反应;创伤后多次连续注射BrdU 3 d后,通过长时间示踪,证实创面愈合后肉芽组织中存在LRCs,而在正常真皮组织中未检测到被BrdU标记的细胞;进一步发现肉芽组织细胞较正常真皮细胞具有更强的集落形成能力,且在肉芽组织细胞形成的集落中仍可检测到BrdU信号阳性的LRCs.结论 创面肉芽组织中存在具有干细胞特性的LRCs,提示皮肤创伤后局部真皮干细胞被激活并参与创伤愈合过程.     

骨髓问充质干细胞对大鼠损伤汗腺的修复性研究

目的探讨皮肤汗腺受损后骨髓间充质干细胞对其的修复效果。方法大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养、标记。机械损伤大鼠脚掌汗腺,干细胞治疗组于创面周围皮下注入MSCs,对照组注射相同剂量PBS,分别比较两组的创面愈合率及再生上皮的厚度,观察MSCs参与受损汗腺修复的情况。结果7d时干细胞治疗组的创面愈合率及14d时的表皮再生厚度均优于对照组（P〈0．05）;BrdU标记的MSCs参与了损伤汗腺导管部的修复。结论骨髓间充质干细胞有利于创伤皮肤的修复并可能参与损伤汗腺的修复。     

人参皂苷Rg1对植入痴呆大鼠海马中BMSCs存活、分化的影响及其机制

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）植入痴呆大鼠海马中的存活、分化情况及人参皂苷Rg1对其的影响及其机制。方法：雄性SD大鼠45只,采用随机数字法分为双侧穹窿海马伞（FF）切断模型组（模型组）：阿尔茨海默病（AD）模型;BMSCs移植治疗组（BMSCs组）：在模型制作2周后,每只大鼠接受1＆#215;106个BMSCs治疗;间充质干细胞联合人参皂苷Rg1治疗组（联合治疗组）：两者联合与BMSCs组同时进行。采用免疫组织化学法检测海马BrdU阳性细胞数,免疫组织化学双染法检测NSE、BrdU双染阳性细胞,RT-PCR技术检测海马神经生长因子（NGF）mRNA表达。结果：模型组在FF切断术后6周,联合治疗组BrdU阳性细胞数（34.2±5.4）较BMSCs组（10.3±4.3）多（P＜0.05）。联合治疗组海马NGF mRNA表达水平（1.13±0.21）较BMSCs组（0.75±0.12）有所升高（P＜0.05）。结论：人参皂苷Rg1能够促进植入AD模型大鼠海马中的BMSCs生存,其机制可能与人参皂苷Rg1能够提高AD模型大鼠海马组织NGF mRNA的表达有关。     

静脉注射骨髓基质细胞对脑梗死大鼠血管内皮生长因子表达的研究

目的：观察静脉注射的骨髓基质细胞（MSC）在大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型大鼠脑内分布及血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法：采用Longa线栓法建立Wistar大鼠MCAO再灌注模型；从大鼠后肢骨髓分离、培养MSc；CD34、CD44、CD54免疫细胞化学染色鉴定MSC；5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记的MSC注射给动物模型，免疫组织化学染色观察BrdU阳性细胞分布及VEGF表达。结果：体外培养的MSC具有多态性和贴壁生长特性，多次传代后细胞生物学特性没有明显改变；MSC表达CD34（-）、CD44（＋）、CD54（＋）；治疗组BrdU阳性细胞主要分布于梗死灶周围。VEGF表达比对照组多（P〈0．05）。结论：静脉注射的MSC能游走、迁移至太鼠缺血脑组织并存活，同时促进VEGF表达。     

免疫荧光双标法在小鼠表皮干细胞分子标记筛选中的应用

目的用标记滞留细胞(LRCs)及免疫荧光双标记法进行小鼠表皮干细胞可靠分子标记的筛选。方法选择出生5 d的昆明小乳鼠进行腹腔注射5-溴,2-脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU),隔日注射,连续7 d。于注射后第90天进行取材,在冰冻切片上分别进行BrdU与整合素β1、P63和CD34的双重免疫荧光标记,观察这些标记物与BrdU的符合度。结果 90 d后小鼠皮肤上皮细胞中仍有少数阳性细胞,主要存在于毛囊的隆突部位,另有少数阳性细胞散落在基底层。免疫荧光双标的结果示,Brdu与整合素β1双标阳性的细胞占所有整合素β1阳性细胞的81%,占所有Brdu阳性细胞的94%;Brdu与P63双标阳性的细胞占所有P63阳性细胞的65%,占所有Brdu阳性细胞的86%;Brdu与CD34双标阳性的细胞占所有CD34阳性细胞的30%,占所有Brdu阳性细胞的62%。结论整合素β1与BrdU的符合率最高,P63其次。β1和P63是这些分子标记物中筛选干细胞最好的指标。     

提高BrdU标记成年大鼠在体脑神经干细胞增殖和分化效率的研究

目的探讨合理利用BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）单标成年在体脑神经干细胞增殖以及双标成年在体脑神经干细胞分化的策略。方法在BrdU通过腹腔注射6h后或在BrdU腹腔注射后14～21d将大鼠灌注固定,继之用邻片进行H—E染色以作定位,分别对脑组织切片进行BrdU单标或BrdU＋NT（神经丝,成熟神经元的标志物）、BrdU＋GFAP（胶质原纤维酸性蛋白,成熟星形胶质细胞的标记物）以及BrdU＋GC（半乳糖脑苷脂,成熟少突胶质细胞的标记物）的双标免疫组织化学反应,光镜下观察和计数单标或双标的阳性细胞。结果BrdU单标阳性细胞多见于侧脑室的SVZ（室管膜下区）和SGZ（齿状回颗粒下区）,而BrdU＋NT阳性细胞多位于嗅球和齿状回的颗粒细胞层,BrdU＋GFAP阳性细胞多见于SVZ或SGZ;BrdU＋GC阳性细胞数最少,散在分布于以上四个部位内。结论在进行BrdU标记脑神经干细胞前应该制定优化组合方案,以获得最佳的单标和双标的识别效果。     

小鼠子宫内膜干细胞的存在及其分布规律

目的 通过标记滞留细胞技术检测昆明小鼠子宫内膜干细胞的存在及其分布规律.方法 取出生3 d雌性乳鼠皮下注射BrdU 50 μg/g体重,连续3 d.分别在注射后第1、2、3、4、6 和8周取子宫.采用免疫组化SP法检测子宫内膜BrdU的表达情况,并在高倍镜下计算阳性细胞百分率.结果 BrdU阳性细胞在第1周时在内膜上皮及基质部均广泛表达,但阳性细胞的数量随时间逐渐下降,至第8周时则主要位于基质部血管周围以及基质与肌层交界处.结论 小鼠子宫内膜基质中存在成体干细胞.     

大鼠脑梗死后室周带神经干细胞增殖和迁移

目的：研究成年大鼠脑梗死后室周带神经干细胞的增殖及迁移。方法：制作大鼠脑梗死模型，将其分为脑梗死后3、5、7和14d组，对照组为假手术组：采用免疫组化法动态检测大鼠脑内5-溴脱氧尿苷嘧啶（BrdU）、双皮质素（DCX）的表达。结果：与对照组相比，室周带BrdU阳性细胞在脑梗死后逐渐增加，并于7d达高峰，14d后开始下降，但仍高于正常水平。梗死后不同时间组室周带BrdU阳性细胞数均高于对照组（P〈0．01）。DCX阳性细胞具有迁移细胞的形态学特征，并向损伤区迁移，于术后5d迁移细胞的数量达高峰。结论：脑梗死可激活室周带神经干细胞原位增殖，并向损伤区迁移。     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外诱导分化为人汗腺细胞（hSGCs）。方法：体外分别分离培养hMSCs和hSGCs,原代培养hSGCs融合后,收集细胞,制备汗腺细胞匀浆,用含10%汗腺细胞匀浆的汗腺培养基来诱导培养hMSCs。1周后,检测诱导培养的hMSCs的抗原表达。结果：培养的hSGCs表达CK19和CEA;hMSCs表达CD44、105,不表达CK19、CD34和CEA。诱导培养1周,免疫细胞化学染色示诱导培养组少量细胞表达CEA和CK19,而对照组未见CEA和CK19阳性细胞;流式细胞仪检测CEA在诱导培养组的阳性表达率约为（6.2±1.2）%,对照组（0.9%±0.0）%（P〈0.05）。结论：在无完整汗腺细胞存在的情况下,hMSCs在体外也可诱导分化为hSGCs。     

小鼠子宫内膜干细胞的研究

目的 通过标记滞留细胞技术检测昆明小鼠子宫内膜干细胞的存在及其分布规律。方法 取出生3d雌性乳鼠皮下注射BrdU 50ug/g体重,连续3d。分别在1 、2 、3 、4 、6 和8周取子宫。采用免疫组化SP法检测子宫内膜BrdU的表达情况,并在高倍镜下计算阳性细胞百分率。 结果 BrdU阳性细胞在第1周时在内膜上皮及基质部都广泛表达，但阳性细胞的数量随时间逐渐下降，至第8周时则主要位于基质部血管周围以及基质与肌层交界处。结论 小鼠子宫内膜基质中存在成体干细胞。 【关键词】 子宫内膜；标记滞留细胞 ；BrdU ；干细胞； 免疫组化     

骨髓间充质干细胞促进损伤汗腺修复的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)分化为创面皮肤汗腺细胞的可能性及其参与创面修复的可能机制。方法无菌条件下取雄性Wistar大鼠(6只)股骨骨髓细胞,分离、纯化、体外扩增培养MSCs后,应用溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记技术标记细胞。雄性Wistar大鼠(30只)正常喂养1周后按随机数字表法分为2组:模型组和对照组(各15只),模型组大鼠背部正中,制备1cm×1cm全层皮肤缺损创面。从对照组和模型组大鼠尾静脉输注BrdU标记的MSCs(5×106 mL-1)0.1mL;术后第7天与第10天切取创面组织,采用PowerVisionTM免疫组织化学染色法检测BrdU。结果在创面皮下汗腺导管周围发现BrdU阳性细胞,且汗腺中也有呈现BrdU阳性的细胞。结论创面愈合过程中,MSCs归巢并参与创面修复;在创面微环境下,MSCs可分化为汗腺细胞,并参与创面修复。     

长期摄入低浓度酒精对大鼠胃黏膜热休克蛋白表达的影响

目的：探讨长期低浓度酒精刺激对大鼠黏膜热休克蛋白70（HSP70）表达的影响。及其在适应性细胞保护作用中的意义。方法：以6％的酒精水溶液作为大鼠饮水的唯一来源，用免疫组化技术观察饮酒不同时程中大鼠黏膜HSP70阳性细胞的分布情况，并对不同的胃腺细胞通过形态学观察或HSP70与增殖细胞核反应抗原（PCNA）免疫双重染色进行鉴定，结果：正常对照组大鼠的主细胞呈HSP70弱阳性反应。饮用酒精水溶液1天的大鼠，胃腺表面黏液性细胞呈HSP70强阳性反应，主细胞弱阳性反应。饮用3－14天的大鼠，HSP70阳性细胞分布于胃黏膜表面，胃腺颈部和胃基底部，胃腺颈部HSP70阳性细胞经PCNA和HSP70免疫双重染色 实为胃腺干细胞，饮用28天的大鼠HSP70阳性细胞分布区域和饮用1天的大鼠相同。结论：适当低浓度的酒精刺激可引起胃黏膜干细胞HSP70的表达，并可能在大鼠胃黏膜的适应性细胞保护机制中起重要作用。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。     

小鼠皮肤干细胞染色体非随机分配方式的研究

目的：以小鼠皮肤干细胞为研究对象,对无论干细胞分裂多少次的一组DNA“永生化”链,能持续存在于干细胞基因组中的这一假说进行验证。方法：利用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入法,检测发育期和成年期标记的小鼠皮肤BrdU阳性细胞存在情况。结果：免疫组化结果表明,BrdU标记停止后24h,发育期和成年期标记的小鼠皮肤上皮细胞均为阳性,阳性部位为细胞核,7天后仍为阳性。90天后发育期小鼠皮肤上皮细胞中仍有少数阳性细胞,它们主要存在于毛囊的隆突部位,另有少数阳性细胞散落在基底层。但成年期小鼠30天后皮肤BrdU阳性上皮细胞已全部转为阴性。结论：本实验结果证实,小鼠皮肤干细胞中存在DNA永生化链,其染色体发生了非随机分配。     

骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肾脏podocin表达的影响

目的：研究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）对糖尿病肾病大鼠足细胞相关分子podocin表达的影响及其对肾脏的保护作用。方法：将清洁级雄性SD大鼠52只随机分为正常组（n=13）、造模组（n=39）,正常组给予普通饲料,造模组则高脂高糖喂养,8周后造模组一次性腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin,STZ）35 mg·kg-1,糖尿病肾病造模成功后将造模组随机分为BMSCs组（n=13）、前列地尔组（n=13）及DN组（n=13）。于造模成功的当天,BMSCs组大鼠经尾静脉注射经体外培养、鉴定、Brdu标记后的BMSCs 2×106·ml^-1,前列地尔组大鼠经腹腔注射前列地尔4μg·kg-1·d^-1,而DN组及正常组则注射同等剂量的生理盐水。于注入后的1、14、28 d检测4组大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）水平;光镜下观察肾脏组织病理变化,荧光显微镜下观察BMSCs在肾脏的定位;利用免疫组化、Western-blotting检测肾组织podocin的表达。结果：BMSCs移植后28 d,与DN组和前列地尔组相比,BMSCs组大鼠尿蛋白、Scr、BUN水平均有下降（P〈0.05）;BMSCs组podocin的表达较正常组降低,但较DN组和前列地尔组明显上升（P〈0.05）;BMSCs组大鼠肾组织可见Brdu标记的阳性细胞。结论：BMSCs可以上调足细胞相关分子podocin的表达,改善足细胞融合,并促进足细胞再生,从而减少尿蛋白,对肾脏起到一种保护作用。     

骨髓基质细胞治疗大鼠局灶性脑缺血的疗效评价

目的：观察静脉注射骨髓基质细胞（BMSC）治疗大鼠局灶性脑缺血的疗效。方法：取健康Wistar大鼠45只,雌雄不限,随机分为骨髓基质细胞组（治疗组）,生理盐水组（实验对照组）和空白对照组。Fridenshtein方法分离培养骨髓基质细胞,免疫细胞化学法鉴定骨髓基质细胞,改良Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）1h模型。栓塞24h后,治疗组股静脉注射经BrdU标记的终浓度为3×10^6个/ml骨髓基质细胞1ml,实验对照组股静脉注射1ml生理盐水,空白对照组股静脉不注射。采用免疫组化法检测脑内BrdU阳性细胞的表达,神经功能损伤评分（NSS）检测大鼠神经系统功能,进行疗效评价。结果：免疫细胞化学方法鉴定骨髓基质细胞为CD34（-）,CD54（＋）、CD106（＋）、CD44（＋）。栓塞后3,7,14d在缺血侧半球可以发现大量BrdU阳性细胞,对侧半球也可见少量BrdU阳性细胞。治疗组和两个对照组相比各时间点的神经功能评分均偏小,在栓塞14d时有显著性差异（P〈0.05）。结论：骨髓基质细胞（BMSC）静脉注射后大鼠的神经功能明显得到了恢复,故认为静脉注射骨髓基质细胞治疗局灶性脑缺血简便易行,并且有效。     

三碘甲状腺原氨酸促进2VO大鼠侧脑室下区的神经再生

目的：探讨三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine,T3）对双侧颈总动脉结扎（2-vessel occlusion,2VO）大鼠侧脑室下区（subventri（sular zone．svz）神经再生的影响。方法：雄性SD大鼠完全随机分为假手术组,2VO组和缺血后T3干预组,每组8只,采用双侧颈总动脉永久性结扎术制备慢性脑缺血模型,术后各组大鼠连续7d腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine,BrdU）标记增殖细胞。各组5只分别于第7、14天灌注取脑组织,采用BrdU与Doublecortin（DCX）免疫荧光双染法标记新生神经元;各组3只取新鲜脑组织分离SVZ,采用免疫印迹法检测DCX蛋白的表达水平。结果：T3作用7d后,T3干预组BrdU阳性细胞较假手术组显著增多（P=0．002）,与2VO组差异无统计学意义（P=0．084）;且BrdU／DCX阳性细胞较2VO组和假手术组均显著增多（均P〈0．05）。T3作用14d后,T3干预组BrdU阳性细胞和BrdU／DCX阳性细胞均显著多于2VO组和假手术组（P〈0．01）。与2VO7d组相比,2VO14d组BrdU阳性细胞和BrdU／DCX阳性细胞显著减少（P〈0．05）。免疫印迹法也显示T3组DCX蛋白的表达水平较多、结论：T3可促进慢性脑缺血大鼠侧脑室下区新生神经元的增殖,提高存活率,促进神经再生。     

皮肤软组织扩张术对大鼠表皮细胞增殖分化的影响

目的观察皮肤软组织扩张术对大鼠表皮细胞增殖分化的影响。方法36只Wistar大鼠分为干预侧和假手术侧，制作皮肤扩张动物模型，利用表皮干细胞表达角蛋白（keratin 19，K19）、短暂扩充细胞表达K14及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen。PCNA）的特点，采用免疫组织化学PowerVision^TM二步法检测扩张皮肤表皮干细胞和短暂扩充细胞的分布特征。结果扩张皮肤的表皮层明显增厚，不仅其基底层K19、K14和PCNA阳性细胞的数量明显增多。而且在棘层和颗粒层也可见K19、K14及PCNA阳性细胞的表达。结论皮肤软组织扩张术的应力能诱导大鼠表皮干细胞的增殖与分化，其可能是皮肤软组织扩张术的重要生物学基础。     

川芎嗪对大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室下区细胞增殖的作用

目的 观察川芎嗪对大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室下区（SVZ）细胞增殖的作用。方法 SD雄性大鼠随机分为假手术组、缺血模型组和川芎嗪组。线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型，川芎嗪组术后2h腹腔注射川芎嗪（80mg／kg，1次／d），各组术后4h腹腔注射5-溴脱氧尿核苷（BrdU，50mg／kg，1次／d）。术后7、14、21d取材，采用免疫组织化学染色观察SVZ BrdU阳性细胞数和Doublecortin（DCX）的表达。结果 缺血模型组术后7d时SVZBrdU阳性细胞较假手术组明显增加（P〈0．01），并持续至14d，21d减少；川芎嗪组14dSVZ BrdU阳性细胞达峰值，21d有所减少，与缺血模型组比较，7、14dBrdU阳性细胞均明显增加（P〈0．01）。缺血模型组7d时SVZ有DCX阳性表达，14d达最多，21d表达减少，与假手术组相应时间点比较均明显增加（P〈0．01）；川芎嗪组随缺血时间延长SVZDCX表达明显增强，21d仍处于高水平，与缺血模型组比较，14、21dDCX表达明显增强（P〈0．01）。结论 川芎嗪对成年大鼠局灶性脑缺血诱导的SVZ神经干细胞／祖细胞增殖可能有促进作用。