IL—2基因转染细胞激活非特异性免疫杀伤细胞的抗肿瘤作用

以ＮＩＨ３Ｔ３细胞作为载体细胞，用基因转染的方法建立了持续分泌白细胞介素２（ＩＬ－２）的细胞株，在体外此细胞上清可以增强小鼠脾细胞和腹腔巨噬细胞对黑色素瘤Ｂ１６细胞的杀伤作用（与对照组比较，均为Ｐ〈０．０１），体内注射基因转染细胞则可以抑制黑色素瘤细胞在体内的生长（与对照组比较，均为Ｐ〈０．０１）。结果表明，分泌ＩＬ－２的成纤维细胞可以通过激活非特异性免疫杀伤细胞而达到抗肿瘤的作用，是一种有较大潜     

脂质体介导CDKN2基因抑制肺癌细胞的实验研究

转染野生型CDKN2cDNA—SA脂质体复合物到NSCLC细胞系A549和SCLC细胞系SH77，用MTT方法测量细胞增殖活力，观察CDKN2基因是否能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。结果：SA阳离子脂质体介导CDKN2基因转染A549细胞后第1、3、5、8日OD值显著小于对照组（P＜0．01），而SH77细胞转染CDKN2基因后1、3、5、8日OD值与对照组比较无差别（P＞0．05）。在体外转染CDKN2基因能显著抑制NSCLC细胞增殖，对SCLC细胞无作用。结果表明肿瘤抑制基因CDKN2可望成为NSCLC基因替代治疗的候选基因。     

CD_3AK细胞加IL-2治疗恶性肿瘤体外与临床应用研究

CD3AK细胞在体外对体外癌细胞系细胞杀伤活性最强，对自体癌细胞杀伤活性与TIL细胞接近，且均显著大于LAK细胞．CD3AK细胞IL－2治疗癌症患者30例中，CR＋PR14例，有效率为46％．Kernofsky的生活质量标准评分治疗后有显著提高（P＜0．01）．血浆IL－2活性治疗后有明显提高（P＜0．05）．T4／T6治疗后有所提高．     

阳离子脂质体介层的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

目的：探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。方法：用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lac Z报告基因的质粒pCAGGS-lacZ按3种方法转染小鼠脾细胞，（1）常规方法直接转染；（2）脾细胞经刀豆球蛋白A（ConA)活化后再按常规方法转染；（3）用黏附辅助脂质体法（adhesion-assisted lipofection,AAL）转染脾细胞。转染效率用X－gal染色法测定。结果：上述3种方法的转染效率依次为＜0．010，0．057及0．199，经方差分析，3种方法转染效率的差异有显著性（P＜0．01，n=3).结论：AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

皮肤T细胞淋巴瘤相关抗原5在肿瘤细胞株中的表达

目的：探讨皮肤T细胞淋巴瘤相关抗原5（cTAGE5）在肿瘤细胞株中的表达及其在肿瘤发生发展中的生物学作用。方法细胞免疫荧光化学检测cTAGE5来源于人的肿瘤细胞株的表达。取阳性表达cTAGE5的人卵巢透明细胞癌ES-2细胞,分为正常对照组、脂质体对照组、siRNA转染组、表柔比星（终浓度1×10－6 mol／L）对照组,平板克隆形成试验和MTT法观察cTAGE5对细胞生长增殖能力的影响,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果cTAGE5 在乳腺癌、肺癌、卵巢癌均有表达,而在胃癌和肝癌肿瘤细胞中表达不明显。与正常对照组比较,siRNA转染组的肿瘤细胞增殖生长抑制（P ＜0．01）,细胞迁移能力降低（P ＜0．01）,表柔比星对照组也显示肿瘤细胞增殖抑制（P ＜0．01）,细胞迁移能力降低（P ＜0．01）。结论 cTAGE5 在不同组织来源的肿瘤细胞株表达存在差异,siRNA 干扰cTAGE5 表达可有效抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力。     

CD3AK细胞介导细胞因子抗肿瘤作用机制的研究

目的：探讨CD3AK细胞介导细胞因子抗肿瘤作用的机制。方法：将卵巢癌细胞株（A2780)分成两组,实验组采用CD3AK＋A2780,对照组采用LAK＋A2780,分别共育24h并于作用前和作用后每4h收集一次上清液以检测TNF－α和IFN－γ分泌水平。结果：实验组和对照组共育前,后上清液中均有TNF－α和IFN－γ分泌,但共育后TNF－α和IFN－γ分泌水平显著高于共育前（P＜0．01）,且同一效靶比的实验组TNF－α和IFN－γ分泌水平明显高于对照组（P＜0．05）。结论：CD3AK细胞可通过分泌细胞因子TNF－α和IFN－γ杀伤肿瘤细胞。     

MMP-9与人黑色素瘤细胞生长相关性的研究

目的 利用多种方法检测金属蛋白酶MMP—9基因与人黑色素瘤细胞生长的相关性。方法 利用细胞记数、MTT、^3H—thymidine掺入实验等方法检测分别转染正义和反义MMP—9CDNA后人黑色素瘤细胞生长速度的改变。结果 转染反义基因后WM45l细胞生长速度受到明显抑制(P＜0．05)；转染正义基因后WM35细胞生长速度受到明显促进(P＜0．05)。而运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达，其结果与对照细胞相似。结论 反义MMP—9基因使人黑色素瘤细胞的生长能力受到一定程度的抑制，正义MMP—9基因使人黑色素细胞的生长能力受到一定程度的促进。说明MMP—9在人黑色素瘤细胞生长过程中起重要作用。同时，四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达。     

抑制糖原合酶激酶活性对老龄大鼠内皮祖细胞增殖的作用机制

【摘要】 目的 探讨抑制糖原合酶激酶3β（GSK3β）活性对老龄大鼠内皮祖细胞（EPC）增殖的作用机制。 方法 密度梯度离心法分离培养老龄大鼠骨髓源性EPC，取对数生长期的EPC，分别加入表达催化GSK3β失活的GSK3β KM基因的重组缺陷型腺病毒pMSCV GSK3β KM（基因转染组）或空病毒pMSCV GFP（对照组）。采用镜下计数法及四氮唑溴盐比色法（MTT）测定EPC增殖能力，荧光激活细胞分离仪（FACS）分析各组EPC细胞周期变化。采用蛋白印迹法测定Wnt信号通路中磷酸化糖原合酶激酶3β（pGSK 3β）、β 连环蛋白（β catenin）及细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的蛋白表达。 结果 与对照组比较，基因转染组EPC数量显著增加(P＜001）；MTT法检测基因转染组EPC在490 nm 吸光度值与对照组比较差异有统计学意义（P＜001）；FACS分析显示基因转染组细胞周期S期比例较对照组显著增加（P＜001）；蛋白印迹法测定显示，与对照组比较，基因转染组pGSK 3β、β catenin及cyclinD1的蛋白表达显著增加（P＜001）。 结论 抑制EPC的GSK 3β活性可通过激活Wnt信号通路促进老龄大鼠EPC的增殖能力。     

四种不同组织来源LAK细胞的体外扩增及抗肿瘤作用的比较

目的：比较四种不同组织来源LAK细胞的体外扩增及抗肿瘤作用。方法：选用脐带血制备LAK细胞，并与临床常用的外周血、胎脾及胸腺LAK细胞在体外扩增及抗肿瘤作用方面比较。结果：脐带血的扩增能力显著高于其余3种LAK细胞（P＜0．01），每份脐带血LAK细胞总数可增殖至2．5×1010；抗肿瘤活性以脐带血LAK对SMMC-7221肝癌细胞出现最早（第3d）、活性最强（85％±3％），明显强于其余三者（P＜o．01）；对K562的杀伤作用仍属脐带血LAK最强；而胸腺LAK的活性最弱。结论：脐带血LAK细胞体外增殖快，杀伤活性强，可用于肿瘤的过继性免疫治疗。     

Antitumor Effects of the Fibroblasts Transfected TNF-α Gene and its Mutants

Summary: To compare the anti-tumor effects of transmembrane TNF-α (TM-TNF) and secreted TNF-α (S-TNF) in vivo, mouse fibroblasts NIH3T3 were transfected separately with three types of retrovirus containing wild type TNF-α (Wt-TNF), TM-TNF mutant (TM-TNFm), S-TNF mu tant (S-TNFm). Southern blot, RT-PCR, FACS and bioassay were used to investigate TNF-α gene integration, expression and its biological activity. It was found that both fixed cells and supernatant of NIH3T3/Wt-TNF, the fixed cells of NIH3T3/TM-TNFm and the supernatant of NIH3T3/S-TNFm could express high level of TNF-α or its mutants and effectively kill H22 in vitro. The trans fected NIH3T3 were separately injected into the mice at the sites of H22 tumor cell inoculation ac cording to a ratio of 5: 1 or 1: 1 (effector/target cells, E/T) after the third day of H22 challenge,respectively. At the E/T= 5 : 1, the NIH3T3/TM-TNFm induced the highest tumor regression,while NIH3T3/S-TNFm exerted the strongest tumor depressing effect at the E/T= 1 .: 1 in vivo. No obvious side effects were noted throughout the course of treatment. The results suggest that both TM-TNF and S-TNF could cause tumor regression. The anti-tumor effect of TM-TNF would be more powerful and safe than that of S-TNF at the proper E/T ratio.     

成纤维细胞介导的白细胞介素2基因疗法的免疫增强作用及其抗肿瘤效果

为了使白细胞介素２（ＩＬ－２）在体内持续有效地发挥生物学效应，作者探讨了成纤维细胞为介导途径的ＩＬ－２基因疗法以及该疗法在小鼠体内的抗肿瘤作用。将基因转染后、高分泌ＩＬ－２的成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＬ－２＋）包裹入胶原后移植入小鼠腹腔内，可使小鼠血清中持续性地存在一定水平的ＩＬ－２，并能非常显著地增强小鼠脾细胞的增殖反应、天然杀伤细胞（ＮＫ）活性和淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ）活性、分泌细胞因子（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、ＩＬ－２）的水平，尤其有意义的是诱导出内源性的ＬＡＫ活性。ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＬ－２＋腹腔内移植后对腹水型肝癌小鼠有较显著的治疗效果，当与ＬＡＫ细胞腹腔内注射联合应用后，治疗效果更佳，表明成纤维细胞介导的ＩＬ－２基因疗法能通过增强机体的免疫功能发挥显著的抗肿瘤作用，而且当其与ＬＡＫ细胞过继回输合用后抗肿瘤作用更强。     

重组人白介素-10对TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞syndecan-4蛋白表达的影响

目的观察重组人白介素-10（IL-10）对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激的血管外膜成纤维细胞（NIH／3T3细胞）增殖和syndecan-4蛋白表达的影响。方法采用体外培养的NIH／3T3细胞,分别应用终质量浓度为20ng／mL TNF-α、100ng／mL IL-10、200ng／mL IL-10、100ng／mL IL-10联用20ng／mL TNF-α、200ng／mL IL-10联用20ng／mL TNF-α作用24h,并设对照组进行比较,采用MTS／PMS法确定NIH／3T3细胞的增殖状态,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定NIH／3T3细胞中syndecan-4蛋白的表达。结果（1）MTS／PMS法测定各组细胞增殖率统计分析显示：与对照组比较,TNF-α组能显著刺激NIH／3T3细胞的增殖（P〈0．001）,而IL-10不同剂量组单独应用对NIH／3T3细胞的增殖均无明显作用（P〉0．05）。IL-10联合TNF-α共同作用组与TNF—α组比较,NIH／3T3细胞增殖均显著减少（P〈0．01）。（2）Western blot蛋白免疫印迹法测定显示：与对照组比较,TNF—α组能显著刺激NIH／3T3细胞中的syndecan-4蛋白表达（P〈0．05）,而IL-10不同剂量组单独应用对NIH／3T3细胞的syndecan-4蛋白表达均无明显影响（P〉0．05）。IL-10联合TNF-α共同作用组与TNF-α组比较,NIH／3T3细胞的syndecan-4蛋白表达显著降低（P〈0．001）。结论IL—10可明显抑制TNF-α诱导的NIH／3T3细胞增殖及细胞syndecan-4蛋白的表达。     

三级淋巴器官(TLO)诱导形成及其在抗肿瘤免疫中的功能研究

目的 在体外诱导形成三级淋巴器官(tertiary lymphoid organs,TLO),并评价其在抗肿瘤免疫中的功能.方法 利用慢病毒系统在NIH3T3细胞上过表达淋巴毒素-β受体(lymphotoxin-beta receptor,LTβR),并检测LTβR-NIH3T3细胞中LTβR的过表达效率;通过免疫印迹...     

体内直接导入转基因IL-2包装细胞的抗癌作用

利用构建分泌人IL－2的逆转录病毒的包装细胞，直接体内注射，观察了对B16小鼠黑色素瘤生长影响及转基因效果。狭缝印迹分析结果显示，B16细胞在体内获得IL－2mRNA表达。同时，肿瘤生长受到抑制，表现在小鼠成瘤与存活时间延长，免疫功能也获得增强，IFN-γ下水平升高。本结果与本室以往报道的体外基因转移的动物实验结果相符，提示直接体内注射病毒包装细胞可转移外源基因及显示抑瘤作用。     

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。     

大鼠胶质瘤细胞中生物钟基因Period2的生物节律性研究

目的揭示生物钟基因Period2(Per2)在鼠胶质瘤C6细胞内周期表达规律。方法采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA)分别刺激体外培养的大鼠胶质瘤C6及NIH3T3细胞,在ZT0-ZT48之间设14个时间点,最初PMA的刺激时间记为ZT0,均在PMA刺激后每隔4h分别提取C6及NIH3T3细胞总RNA。利用标准曲线法Real-time PCR检测相应时间点Per2的mRNA的表达水平。结果 C6细胞中生物钟rPer2基因表达最高点在ZT28,最低点在ZT16;NIH3T3细胞中生物钟mPer2基因表达最高点在ZT24,最低点在ZT12,两者均呈现明显的节律性;C6细胞与NIH3T3细胞同时间点Per2基因表达差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论经PMA诱导后,Per2在C6及NIH3T3细胞均呈节律性表达,但二者表达节律存在明显差异,可作为研究生物种基因与胶质瘤的时间生物治疗的理论基础。     

重组Nox1在NIH3T3细胞中的表达及其对活性氧的影响

目的构建Nox1的真核表达载体，探讨其在NIH3T3细胞中表达后对活性氧水平和药物细胞毒易感性的影响。方法构建携带Nox1基因的真核表达载体pcDNA3-Nox1，并将其转染NIH3T3细胞，采用RT-PCR方法检测Nox1在mRNA水平上的表达，检测细胞活性氧和细胞活力。结果RT-PCR显示转染后的NIH3T3细胞可以有效地转录Nox1 mRNA，细胞中的活性氧水平明显升高，同时对As2O3细胞毒作用更加敏感。结论含有Nox1 cDNA的重组质粒pcDNA3-Nox1转染细胞后可有效表达Nox1，使活性氧水平升高，并因此增加细胞对药物细胞毒的敏感性。     

CML自体树突状细胞对CML白血病细胞作用的研究

目的　研究慢性粒细胞白血病 (CML)自体树突状细胞 (DC)对费城 (Ph)染色体细胞的作用。方法　采用液体培养法从 4例 CML 慢性期患者外周血单个核细胞 (PBMNC)中培养出 DC及 T细胞 ,而后将 DC加 IL- 2或 IL- 2激活的 T细胞 ,分别与自体 PBMNC及 K5 6 2细胞共同孵育 6 h,行常规染色体测定 ,分析自体及 K5 6 2 Ph+染色体细胞残存率。结果　从 4例 CML 患者 PBMNC中培养出约 3× 10 5～ 2× 10 6 PBMNC的自体 DC;DC加 IL-2激活的 T细胞比单用 IL- 2激活的 T细胞对自体 Ph+染色体细胞的杀伤作用强 (P<0 .0 0 1) ;DC激活的自体 T细胞对自体 Ph+染色体细胞的杀伤作用强于对 K5 6 2 Ph+染色体细胞的杀伤作用 (P<0 .0 0 1)。结论　 DC激活的 T细胞能有效抑制 Ph+染色体细胞 ;CML 患者 DC激活的自体 T细胞对自体 Ph+染色体细胞特异性的杀伤作用可能受到主要组织相容性 (MHC)的限制     

临床试剂rIL-2和实验试剂IL-2对γδT细胞体外扩增影响的研究

目的检测经临床试剂重组白细胞介素2(rIL-2)和实验试剂白细胞介素2(IL-2)体外辅助扩增后γδT细胞的细胞纯度及对肿瘤细胞的细胞毒性差异。方法应用梯度离心法分离10例正常人外周血单个核细胞,经IL-2和唑来膦酸(Zol)联合刺激γδT细胞进行扩增,采用流式细胞仪鉴定γδT细胞及其纯度,并检测其对肿瘤细胞的细胞毒性作用。结果在Zol存在的情况下,经实验用IL-2刺激的γδT细胞纯度最高达97.3%,经临床试剂rIL-2刺激的纯度为51.42%(P<0.05),且IL-2扩增后的γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用较rIL-2明显。结论在Zol的存在前提下,IL-2能促使人外周γδT细胞迅速增生,达到实验所需要的细胞纯度,并对肿瘤细胞具有较强的细胞毒性作用,而rIL-2则不能。