pRetro-On/LTβR在Jurkat细胞中表达和诱导细胞凋亡的研究

目的:构建pRetro-On/LTβR载体,获得可表达淋巴毒素β受体((lymphotoxin beta receptor,LTβR)的Jurkat细胞,探讨LTβR在T细胞凋亡中的作用?方法:应用PCR技术扩增LTβR cDNA片段,将PCR产物纯化后定向连接入pRetro-On载体;重组质粒转入大肠杆菌,LB-Amp培养基筛选阳性克隆,经质粒抽提?纯化?NotⅠ和BamHⅠ双酶切?测序,验证pRetro-On/LTβR载体的正确构建;通过脂质体转染T细胞传代系Jurkat细胞;强力霉素(doxycycline,DOX)诱导后,Western blot鉴定转染细胞中LTβR蛋白的表达,流式细胞术检测细胞表面LTβR表达;以配体LIGHT刺激表达LTβR的Jurkat细胞后以annexin-V-PI双染色流式细胞法检测细胞的凋亡?结果:双酶切及测序结果证实LTβR cDNA正确插入pRetro-On质粒;Western blot和流式细胞术结果证实了LTβR在Jurkat细胞内经DOX诱导得到了表达;表达LTβR的Jurkat细胞经LIGHT刺激后凋亡增加?结论:成功构建pRetro-On/LTβR质粒,pRetro-On/LTβR在Jurkat细胞中可以表达;表达LTβR的Jurkat细胞可以通过LIGHT-LTβR途径导致细胞凋亡?     

SLE患者外周血单核细胞LTβR的异常表达及其影响因素初探

目的:观察淋巴毒素β受体(LTβR)分子在系统性红斑狼疮(SLE)外周血单核细胞上的表达情况,同时探索能够影响其表达的因素?方法:分离SLE患者及正常健康对照者的外周血单个核细胞,流式细胞术检测LTβR分子在单核细胞上的表达,免疫磁珠法分选出单核细胞,RT-PCR方法检测其mRNA的表达;同时在体外培养细胞的U937和THP1中观察脂多糖(LPS)?佛波酯(PMA)及地塞米松(DEX)对LTβR分子表达的影响?结果:SLE患者外周血单核细胞上出现LTβR分子的异常高表达,而正常人外周血单核细胞上没有表达;体外细胞培养发现,地塞米松对U937细胞上的LTβR的表达具有上调作用,而对THP1细胞和正常对照者外周血单核细胞没有上调LTβR的表达;PMA可使U937和THP1细胞膜上LTβR出现一过性的降低,但不影响其mRNA水平,对正常人单核细胞无影响;LPS对U937和THP1细胞及正常人单核细胞的LTβR表达均无影响?结论:LTβR分子在SLE患者来源的外周血单核细胞上具有异常的表达,该分子的表达可能不是仅仅由于单核细胞活化或应用激素类药物引起的;但地塞米松可能对发育早期的单核细胞的LTβR表达具有一定的上调作用?     

可溶性转化生长因子βⅡ型受体对LOVO细胞体外增殖和抗肿瘤免疫的影响

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体细胞外区(sTGF-βRⅡ)基因的真核表达载体,初步探讨sTGF-βRⅡ对大肠癌LOVO细胞增殖及抗肿瘤免疫的影响。方法:采用DNA重组技术构建sTGF-βRⅡ的表达载体,用脂质体转染技术转染人大肠癌LOVO细胞,以RT-PCR、Western blot法检测目的基因及其蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和平板法集落形成实验检测sTGF-βRⅡ对LOVO细胞增殖的影响。用淋巴细胞提取液提取外周血淋巴细胞,并与转染了sTGF-βRⅡ的大肠癌LOVO细胞共同培养,用流式细胞仪检测各实验对照组T淋巴细胞亚群的表达。结果:sTGF-βRⅡ在LOVO细胞中获得表达,sTGF-βRⅡ可抑制TGF-β1作用下的LOVO细胞增殖(P<0.01),与淋巴细胞共同培养后的转染组T淋巴细胞亚群的CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞较其它实验组均显著增高(P<0.05)。结论:sTGF-βRⅡ可拮抗TGF-β1的信号传导,抑制TGF-β1作用下的LOVO细胞增殖,进而拮抗TGF-β1的抑制肿瘤免疫作用,使宿主T细胞的抗肿瘤免疫功能得到较大恢复,从而达到抗肿瘤的作用。     

LTβR-Ig融合蛋白的真核表达及其体外生物学功能的研究

目的 为了研究LTβR-Ig的生物学功能,构建重组的LTβR-Ig/pcDNA3.1（＋）真核表达载体,在CHO细胞中表达,无血清扩大培养,并初步研究了融合蛋白LTβR-Ig的体外生物学活性。方法 将鼠LTβR胞外段cDNA与人IgG1 Fc段cDNA共同克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,转染CHO-K细胞表达,阳性克隆进行无血清培养,采用PtoteinA亲和层析的方法进行纯化;3[H]TdR参入法检测对细胞增殖的影响。结果经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序,结果 表明克隆了正确序列的LTβR胞外段序列,成功构建了重组表达质粒LTβR-Ig/pcDNA3.1,并在CHO细胞中稳定表达了LTβR-Ig的融合蛋白,证明LTβR-Ig融合蛋白能抑制混合淋巴细胞反应。结论 本研究建立了能稳定表达有生物活性的LTβR-Ig融合蛋白的真核表达系统,为今后研究LTβR在移植排斥中的作用机制,及开展基因重组药物进行疾病的生物治疗奠定了基础。     

TβR1和p-Smad2/3蛋白在哈萨克族食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

摘要：目的 探讨TGF-β信号通路关键分子转化生长因子β-1型受体(transforming growth factor-β receptor 1,TβR1)和磷酸化Smad2/3(phosphorylated Smad2/3,p-Smad2/3)蛋白在哈萨克族(哈族)食管鳞状细胞癌(鳞癌)中的表达及其临床意义。方法 采用GEO和TCGA数据库分析食管鳞癌标本与癌旁正常组织中TβR1和p-Smad2/3的表达;运用免疫组织化学技术检测127例哈族食管鳞癌组织和82例癌旁正常组织中TβR1和p-Smad2/3的蛋白表达状况,分析及探讨TβR1、p-Smad2/3蛋白表达水平与哈族食管鳞癌患者临床病理参数及预后的关系。结果 TβR1和p-Smad2/3蛋白在哈族食管鳞癌中表达上调(P=4.79×10-7;P=2.21×10-9),且两者的表达呈正相关(r=0.322,P=0.002);TβR1、p-Smad2/3蛋白表达水平与食管鳞癌的浸润深度密切相关(P=0.003;P=0.005),且有淋巴结转移的样本中TβR1、p-Smad2/3蛋白表达水平明显高于无淋巴结转移的样本(P=0.028;P<0.001),而TβR1、p-Smad2/3蛋白表达与食管鳞癌患者年龄、性别和肿瘤分化程度无明显相关(均P>0.05);Kaplan-Meier生存分析显示TβR1和p-Smad2/3蛋白高表达食管鳞癌患者生存时间明显短于低表达患者(P=0.0013;P=0.0017)。结论 TβR1和p-Smad2/3蛋白表达与哈族食管鳞癌患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移及预后密切相关。     

淋巴毒素β受体活化对膀胱癌细胞NF-κB信号通路及细胞增殖的影响

目的 研究淋巴毒素β受体(LTβR)的活化对膀胱癌细胞株5637核转录因子-κB(NF-κB)信号通路及细胞增殖的影响。 方法 以膀胱癌细胞株5637为研究对象,以配体淋巴毒素α1β2(LTα1β2)诱导LTβR信号活化。qRT-PCR检测NF-κB信号通路RelA、RelB mRNA,细胞因子LTα、LTβ、LIGHT、TNFα、IL-6、IL-1β mRNA和增殖相关基因细胞周期素D1(CyclinD1)、生存素(Survivin) mRNA的表达水平;WB法检测NF-κB经典信号通路活化状态;CCK-8法检测细胞增殖水平。 结果 LTβR活化后,RelA mRNA表达上调2.5倍(P=0.003),TNFα、IL-1β、CyclinD1、Survivin mRNA出现不同程度的上调(均P<0.05),随着LTβR表达下调,以上基因mRNA表达也下降(均P<0.05);WB结果显示活化标志蛋白p-p65表达出现升高趋势(P>0.05);与对照组相比,细胞增殖活性的差异未见统计学意义(P>0.05)。 结论 活化LTβR可促进NF-κB经典信号通路主要成员RelA的表达和活化,并有可能通过上调促炎细胞因子TNFα、IL-1β的表达参与膀胱癌炎性微环境的形成;有利促增殖相关基因CyclinD1、Survivin的表达,但在细胞增殖水平上并未见明显效应。      

转化生长因子β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体在子宫内膜腺癌中的表达及意义

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)、Ⅱ型受体(TβRⅡ)在子宫内膜腺癌组织中的表达情况及临床意义。方法采用免疫组织化学的方法检测48例子宫内膜腺癌、19例子宫内膜非典型增生、20例正常增殖期子宫内膜组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ蛋白的表达情况,并结合临床资料进行分析。结果 TGF-β1、TβRⅠ在子宫内膜腺癌、子宫内膜非典型增生中的表达明显低于正常增殖期子宫内膜(P<0.01),TβRⅡ在子宫内膜腺癌、子宫内膜非典型增生及正常增殖期子宫内膜之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ在中、低分化癌组织中的表达明显低于高分化癌组织(P<0.05,P<0.01),但三者的表达与临床分期、肌层浸润、淋巴结转移无明显关系(P>0.05)。正常增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ三者之间表达呈一致性,两两均呈正相关,但子宫内膜腺癌组织中TβRⅠ、TβRⅡ的表达缺乏相关性。结论 TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ表达的异常共同参与了子宫内膜腺癌的发生和发展,但TβRⅠ表达的下调可能是始动因素,起着更关键的作用。     

自噬小体疫苗能够检测人外周血抗原特异性T细胞

目的:探讨自噬小体疫苗DRibbles是否可用于检测人外周血中抗原特异性T细胞.方法:制备表达CEF蛋白的HEK293T细胞及表达CMV pp65蛋白的LT3细胞,从中提取DRibbles,用HEK293T CEFDRibbles及LT3 pp65 DRibbles刺激人外周血单个核细胞(PBMCs),通过流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞占总T细胞的百分比.结果:与阴性对照HEK293T GFP DRibbles相比,HEK293T CEF DRibbles刺激组分泌IFN-γ+的CD8+T细胞比例显著增高(3.38％ vs0.05％),分泌IFN-γ+的CD4+T细胞比例亦显著增高(0.46％ vs0.06％);LT3 pp65 DRibbles刺激组分泌IFN-γ+的CD8+T细胞平均百分数为0.21％,阴性对照LT3 GFP DRibbles刺激组仅为0.05％(P＜0.01);与LT3pp65细胞裂解产物相比,LT3 pp65 DRibbles能诱导更多的CD8+T细胞分泌IFN-γ(P ＜0.05),在诱导CD4+T细胞分泌IFN-γ方面,DRibbles与细胞裂解产物类似(P＞0.05).结论:包含病毒抗原的DRibbles能够有效激活人PBMCs中的病毒抗原特异性CD8+T细胞及CD4+T细胞.     

在支气管上皮细胞恶性转化过程中Smad7表达变化对TGF-βR、SMADs及STRAP蛋白的影响

目的研究永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化过程中,作为Sm ad蛋白家族的抑制分子,Sm ad7对TGF-βR、R Sm ads及STRAP蛋白的表达影响。方法培养BEP2D、BERP35T2细胞及稳定表达Sm ad7蛋白的细胞BS7(来源于BEP2D)、RS7(来源于BERP35T2),提取细胞蛋白,用W estern b lot方法比较稳定转染Sm ad7基因前后的BEP2D和BERP35T2细胞中TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Sm ad2/3、Sm ad4及STRAP蛋白表达差异。结果稳定转染Sm ad7基因后细胞中TGF-βRⅡ表达降低,Sm ad2和STRAP蛋白表达增高,Sm ad3、Sm ad4蛋白表达无变化。结论Sm ad7高表达导致TGF-β信号通路发生改变,其中TGF-βRⅡ表达降低,STRAP表达增高可能是诱使细胞发生恶性转化的机制之一。     

氧糖剥夺/再灌注损伤小胶质细胞通过上调胸腺素β4影响PI3K/AKT信号通路

探究小胶质细胞表达的胸腺素β4（Tβ4）与脑缺血/再灌注损伤（I/R）后PI3K/AKT通路的关系。方法 拟采用局灶脑I/R的模型［21只成年雄性SPF级SD大鼠分为假手术组（Sham组,6只）和模型组（I/R组,15只）］和使用BV2细胞建立氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型（分为对照组、OGD/R组、shRNA Tβ4+Control组、shRNA Tβ4+OGD/R组、Control shRNA+Control组、Control shRNA+OGD/R组）,配合基因干扰技术,使用免疫组化、免疫荧光等方法检测大脑皮层及BV2细胞Tβ4表达水平,蛋白质印迹检测PI3K/AKT通路蛋白水平的变化。结果 与Sham组相比,大鼠局灶脑I/R损伤后,大脑皮层Tβ4蛋白表达显著升高,尤其是I 2 h/R 48 h组（P＜0.0001）。体外实验证实,与Control组相比,OGD/R损伤后Tβ4的在BV2细胞表达明显升高,尤其OGD 6 h/R 48 h组升高最明显（P＜0.0001）, p-PI3K/PIK和p-AKT/AKT比值也升高(P＜0.001),而当Tβ4基因被干扰时,p-PI3K/PIK(P＜0.05)和p-AKT/AKT（P＜0.01）也受到抑制。结论 局灶性脑I/R损伤后,Tβ4在大脑皮质小胶质细胞高表达,并且小胶质细胞高表达的Tβ4可能通过影响PI3K/AKT通路影响大脑缺血/再灌注损伤后的修复。     

硫酸软骨素载药胶束靶向肿瘤细胞内高尔基体治疗肿瘤转移的初步研究

  目的  本研究旨在初步探究共载吡柔比星（pirarubicin, THP）与长春瑞宾（vinorelbine, VRL）的硫酸软骨素胶束（chondroitin sulfate-modified micelles, CSmicelles）的肿瘤细胞内高尔基体的靶向性及其体外抗肿瘤转移效果。  方法  采用流式细胞术考察小鼠乳腺癌细胞株4T1摄取CSmicelles情况及摄取机制;通过共定位实验对CSmicelles的高尔基体靶向性进行初步研究;采用GM130免疫荧光实验考察共载THP与VRL的CSmicelles（THP+VTL-CSmicelles）对高尔基体结构的影响;最后通过细胞划痕实验和Transwell迁移/侵袭实验对THP+VTL-CSmicelles的体外抗肿瘤转移效果进行初步评价。  结果  CSmicelles能显著增加药物的入胞能力,其细胞摄取途径为网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞,为能量依赖性的主动转运,并具有良好的肿瘤细胞内高尔基体靶向性。THP+VTL-CSmicelles能破坏高尔基体结构,显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。  结论  THP+VTL-CSmicelles具有肿瘤细胞高尔基体靶向性,可发挥靶向效应,抑制肿瘤细胞转移。     

PD-L1、BRAFV600E、CD68蛋白表达及肿瘤浸润淋巴细胞在恶性黑色素瘤诊断中的意义

  目的   分析PD-L1、BRAFV600E、CD68蛋白和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）在恶性黑色素瘤诊断中的意义。  方法   应用高通量组织芯片技术及免疫组化方法,检测60例原发性恶性黑色素瘤组织中PD-L1、BRAFV600E、CD68蛋白表达;分析PD-L1、BRAFV600E、CD68蛋白以及TIL与患者的临床病理特征及预后关系。  结果   （1）恶性黑色素瘤组织中CD68蛋白表达与肿瘤T分期之间,差异有统计学意义（P = 0.018）,而与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和溃疡形成之间,差异均无统计学意义（P > 0.05）;（2）PD-L1、BRAFV600E和TIL与肿瘤T分期、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和溃疡形成之间,差异均无统计学意义（P > 0.05）;（3）皮肤黑色素瘤BRAFV600E突变率约36.67%（22/60）,其中,肢端型黑色素瘤BRAFV600E突变率约68.18%（15/22）;黏膜黑色素瘤BRAFV600E突变率约23.33%（14/60）;（4）Cox回归生存分析结果显示肿瘤淋巴结转移是影响恶性黑色素瘤患者预后的因素。   结论   （1）CD68蛋白表达在判定患者预后方面可能有一定作用;（2）皮肤部位的黑色素瘤建议行BRAFV600E免疫组化检测;（3）患者存在淋巴结转移可作为恶性黑色素瘤预后判断的参考指标。     

婴儿利什曼原虫Pepck和Gp63优势表位的真核与原核重组载体的构建与表达

  目的  选取婴儿利什曼原虫的Pepck和Gp63的优势表位基因,构建Pepck-Gp63二联优势表位的原核与真核重组表达载体并表达蛋白。  方法  用计算机分析预测磷酸烯醇丙酮酸羧基酶（phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCK）的二级结构及HLA表位,筛选出优势表位。根据本实验室之前对表面蛋白酶63（glycoprotein of 63×103, GP63）用相同的方法分析而筛选的表位结果,把Pepck和Gp63的优势表位基因通过重叠PCR和酶切连接反应构建出重组原核表达质粒pET32a-Pepck-Gp63,并诱导其在大肠杆菌中表达;构建出重组真核表达质粒pVAX1-Pepck-Gp63,用脂质体转染法把真核质粒转染到NIH3T3细胞中表达。  结果  Pepck存在多个优势表位;测序结果表明二联优势表位基因Pepck-Gp63连接成功;PEPCK-GP63蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达并在SDS-PAGE电泳-考马斯亮蓝染色的结果中呈现相对分子质量为74×103大小的条带;细胞免疫荧光中被pVAX1-Pepck-Gp63转染的NIH3T3细胞呈阳性。  结论  成功构建重组原核表达质粒pET32a-Pepck-Gp63和重组真核表达质粒pVAX1-Pepck-Gp63,并分别在大肠杆菌和NIH3T3细胞中验证重组质粒能表达相应目的蛋白,为后续的免疫策略研究提供初步实验基础。     

共载吡柔比星和长春瑞宾混合胶束的构建及其对乳腺癌的治疗研究

  目的  研究使用硫酸软骨素-胆固醇聚合物（CS-Chol）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-mPEG₂₀₀₀）构建一种共载吡柔比星（pirarubicin, THP）和长春瑞宾（vinorelbine, VRL）的混合胶束（T+V-CS胶束）,并对其治疗乳腺癌的效果进行评价。  方法  用超声-透析法制备T+V-CS胶束并对其理化性质进行表征,用MTT实验和细胞周期实验评价T+V-CS胶束的体外抗肿瘤效果,同时在4T1乳腺癌小鼠模型上研究T+V-CS胶束的体内抗肿瘤效果。  结果  T+V-CS胶束在透射电镜下呈近球形;马尔文粒径为（155.5±4.5） nm,多分散系数（PDI）为0.170±0.003,Zeta电位为（?23.0±0.9） mV;在T+V-CS胶束中,THP的包封率为（81.87±2.56）%,VRL的包封率为（87.54±2.82）%,总载药量为（10.20±1.20）%。体内外药效实验结果表明,与单载药胶束和游离药物溶液相比,T+V-CS胶束具有协同抗肿瘤作用,能诱导G₂/M期的细胞数明显增加,能明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长并延长小鼠生存期。  结论  T+V-CS胶束表现出良好的抗肿瘤效果,对乳腺癌的治疗具有一定的参考意义。     

硼替佐米靶向NF-κB信号通路抑制结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的研究

  目的  研究硼替佐米对结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）的抗肿瘤作用。  方法  单独使用不同质量浓度（0、1、2、4、5、6 ng/mL）硼替佐米处理SNK-6细胞24、48、72 h,及不同浓度核因子-κB （NF-κB）信号通路抑制剂BAY11-7082（0、1、2.5、5、10、20 μmol/L）处理SNK-6细胞24 h后,采用CCK8法检测细胞存活率并计算其半数抑制浓度（IC₅₀）。联合使用30 μmol/L Z-VAD-FMK（Pan-caspase抑制剂）+3 ng/mL硼替佐米,以及5、10 μmol/L BAY11-7082+3 ng/mL硼替佐米处理SNK-6细胞24 h,CCK8法检测细胞存活率。不同质量浓度硼替佐米处理SNK-6细胞24 h后,采用Annexin Ⅴ/PI流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）和Bcl-2的表达,检测NF-κB信号通路相关蛋白P65和P100/52的表达。  结果  硼替佐米可呈剂量依赖性的抑制SNK-6细胞增殖（P<0.05）,24 h IC₅₀﹝（2.87±0.06） ng/mL﹞低于48 h和72 h（P<0.05）。BAY11-7082亦可抑制SNK-6细胞增殖,24 h IC₅₀= （9.73±0.36） μmol/L。联合用药结果表明,Z-VAD-FMK能减弱硼替佐米对SNK-6细胞增殖的抑制作用（P<0.05）,BAY11-7082能增强硼替佐米对SNK-6细胞增殖的抑制作用（P<0.05）。硼替佐米处理SNK-6细胞24 h后,凋亡相关蛋白Caspase-3裂解、PARP激活,以及Bcl-2裂解;NF-κB信号通路相关蛋白P65磷酸化水平降低,P52减少。  结论  硼替佐米通过阻断NF-κB信号通路抑制ENKTL细胞增殖,并且经线粒体介导的Caspase途径诱导ENKTL细胞凋亡。     

人参皂苷Rg1联合抗生素治疗小鼠脓毒症急性肺损伤

  目的  观察人参皂苷Rg1联合抗生素亚胺培南对脓毒症急性肺损伤的影响。  方法  C57BL/6雄性小鼠以盲肠穿刺法建立脓毒症模型,将模型小鼠随机分为模型组、亚胺培南组、人参皂苷Rg1组、人参皂苷Rg1+亚胺培南组,每组10只。另取10只C57BL/6小鼠只开腹不穿刺,作为假手术组。各组于术后2 h、26 h、50 h腹腔注射给药。末次给药2 h后（术后52 h）,取小鼠动脉血液测定氧合指数,取肺组织测定肺脏湿/干质量比,HE染色观察肺脏炎症,ELISA测试盒检测肺泡灌洗液白介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α及核转录因子（NF）-κB的水平,蛋白印迹及免疫组织化学染色检测肺组织NF-κB p65的表达。  结果  各给药组均能够显著降低脓毒症小鼠的肺脏湿/干质量比,并升高血液中的氧合指数（P<0.01）,降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α及NF-κB水平（P<0.01）,同时降低肺组织中NF-κB p65的表达（P<0.01）。人参皂苷Rg1合并亚胺培南应用时,与单用人参皂苷Rg1及单用亚胺培南组相比,上述指标更接近对照组水平。HE染色结果显示给药治疗后的各组脓毒症小鼠的肺泡炎细胞浸润减轻,联合用药组的肺脏组织形态与假手术组最为接近。  结论  人参皂苷Rg1单用和联用均能够抑制脓毒症小鼠的肺脏炎症,以抗生素治疗脓毒症时或可考虑联合使用。     

小檗碱通过激活自噬诱导caspase依赖性凋亡发挥抗结直肠癌作用

  目的  探究小檗碱通过自噬依赖性凋亡发挥抗结直肠功效的潜在作用机制。  方法  使用HCT116细胞和移植瘤模型小鼠进行小檗碱抗肿瘤药效和可能作用机制的研究。体外研究中, 通过利用CCK8实验评价小檗碱对结直肠癌细胞活力的影响, 使用细胞克隆实验评价小檗碱对结直肠癌细胞增殖的影响, 同时借助流式细胞术和TUNEL染色法对小檗碱诱导结直肠癌细胞凋亡作用进行研究。透射电镜和mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染细胞用于检测细胞内自噬流变化。通过对小鼠组织进行HE染色、免疫组化染色和TUNEL染色, 评价小檗碱体内抗结直肠癌作用。  结果  体外研究结果表明, 小檗碱能够抑制结直肠癌细胞活力, 诱导细胞凋亡, 同时提高细胞内LC3B水平。使用自噬抑制剂3-MA、CQ和BafA1进行干预, 自噬抑制剂能够促进HCT116细胞生长, 抵消小檗碱诱导的结直肠癌细胞凋亡作用。雷帕霉素增强小檗碱上调HCT116细胞中LC3B水平的作用, 同时Z-VAD-FMK或ATG siRNA能够废除小檗碱诱导结直肠癌细胞凋亡的作用。在体研究结果表明, 小檗碱能够降低肿瘤体积和重量, 引起肿瘤组织发生凋亡。进一步的体内作用机制研究结果表明, 小檗碱显著抑制p-mTOR表达, 同时显著上调ATG5、ATG7、cleaved-caspase3和cleaved-caspase8表达。  结论  小檗碱能够通过诱导结直肠癌细胞发生自噬, 促进其发生caspase依赖性凋亡, 进而抑制结直肠癌细胞增殖。      

丹参-人参配伍调控MDSCs重塑黑色素瘤免疫微环境的研究

  目的  研究丹参-人参配伍对鼠源黑色素瘤细胞株B16F10体内外免疫微环境的影响及其干预B16F10血行转移的作用机制。  方法  体外构建T淋巴细胞-B16F10共培养体系, 流式细胞术检测丹参-人参配伍体外能否增强T淋巴细胞对B16F10的杀伤能力; 构建B16F10小鼠尾静脉血行转移模型, 利用动物活体成像技术、HE染色法观察丹参-人参体内对B16F10肺转移的作用。利用流式细胞术、免疫组化及免疫荧光技术检测荷瘤小鼠体内CD4+、CD8+T细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)等免疫细胞数量, 利用qPCR技术检测MDSCs增殖的相关mRNA表达水平。  结果  丹参-人参配伍体外可增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤能力, 在体可有效抑制小鼠B16F10肺转移, 增强CD4+、CD8+T细胞浸润, 通过抑制MDSCs增殖的相关mRNA表达水平, 进而抑制转移灶MDSCs的表达。  结论  丹参-人参配伍可通过调控MDSCs重塑黑色素瘤免疫微环境, 达到抑制肿瘤转移的目的。研究为丹参-人参配伍的临床抗肿瘤转移应用奠定基础。      

全反式维甲酸对巨噬细胞中白介素-1β表达的调控及机制研究

  目的  探究全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）对巨噬细胞中白介素（interleukin, IL）-1β表达的调控及作用机制。  方法  巨噬细胞经1 μmol/L ATRA处理24 h后转录组测序,筛选差异表达基因,进行KEGG通路分析、GO功能分析和PPI网络分析。不同剂量ATRA处理巨噬细胞24 h后,qRT-PCR和Western blot验证炎症因子IL-1β的表达水平。Western blot和免疫荧光染色检测核因子（neuclear factor, NF）-κB信号和半胱天冬酶-1（caspase-1）的变化。  结果  测序结果显示,与空白对照组相比,巨噬细胞经ATRA处理后71个差异表达基因上调,KEGG分析显示上调基因参与IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）信号通路等,GO分析显示上调基因参与IL-1β的产生、对脂多糖的反应等生物学过程,PPI分析揭示炎症因子,黏附分子和趋化因子为ATRA作用的核心基因。体外实验表明,ATRA呈浓度依赖性促进巨噬细胞中IL-1β的表达,ATRA组中磷酸化（p）-NF-κB、NF-κB和caspase-1的表达较对照组升高（P<0.05）,且p-NF-κB发生了核转移。  结论  ATRA可能通过激活巨噬细胞中的NF-κB信号和caspase-1促进炎症因子IL-1β的表达。