人CTGF和TIMP1基因重组腺相关病毒双表达质粒的构建及其活性检测

 目的 构建人结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP1)基因腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）表达质粒，并观察其在HEK293细胞中的表达，检测目的蛋白的生物学活性。方法 采用PCR技术，分别设计引物扩增所需序列并进行PCR鉴定。再采用分子克隆的方法，以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites, IRES)序列连接CTGF和TIMP1并克隆到AAV表达质粒pSNAV2.0构建重组质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞，用双重免疫荧光和Western blot的方法对重组质粒的表达进行研究，MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性，ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果 PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的CTGF和TIMP1基因序列的AAV表达质粒。双重免疫荧光和Western blot检测到目的蛋白的表达，转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性，ELISA法结果证实重组载体能够高表达TIMP1蛋白。结论 成功构建了双表达质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TIMP1，转染 HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的目的蛋白，为基因治疗椎间盘退变的研究工作奠定了基础。     

人基质金属蛋白酶组织抑制剂1腺相关病毒表达质粒的构建及检测

目的构建含人基质金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinases1，TIMPl）的腺相关病毒（adenoassociatedvirus，AAV）表达质粒并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达，为进一步逆转椎间盘退变提供依据。方法以含有人TIMP1基因序列的质粒pBLAST49-hTIMP1为模板，通过PCR的方法扩增出TIMP1基因，再采用分子克隆的方法，把TIMP1克隆到AAV表达质粒pSNAV2．0构建重组质粒pSNAV2-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞，用免疫荧光和Westernblot的方法对重组质粒的表达进行研究，ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的TIMP1基因序列的AAV表达质粒pSNAVz-TIMP1。体外成功转染入HEK293细胞，免疫荧光、Westernblot及ELISA的结果表明重组质粒能够高表达TIMP1蛋白。结论成功构建了表达TIMP1的重组质粒pSNAV2-TIMP1，并证实在蛋白质水平获得了表达，为进一步逆转椎间盘退变研究奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子腺相关病毒包装质粒pSNAV-hVEGF165的构建及在HEK293细胞的表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）腺相关病毒（adenoassociated virus，AAV）表达载体包装质粒pSNAV-VEGF165，并体外检测pSNAV-VEGF165表达和生物学活性。方法采用分子克隆技术，从pcDNA3（＋）-VEGF165质粒获得VEGF165cDNA，并克隆至AAV包装质粒pSNAV上，构建pSNAV-VEGF165的AAV重组质粒，经酶切及测序鉴定正确，用脂质体介导pSNAV-VEGF165转染HEK293细胞和血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC），荧光免疫组化方法检测VEGF165蛋白，并用MTT法测定VEGF165对VEC增殖的影响。结果经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-VEGF165构建成功，荧光免疫组化显示VEGF165蛋白的表达，对照组未见VEGF165蛋白的表达，MTT法显示VEGF165蛋白对VEC增殖有促进作用。结论构建的AAV包装质粒pSNAV-VEGF165在体外具有生物学活性，可作为AAV-VEGF165表达载体的包装质粒。     

人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

目的构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体．并在HEK293细胞中表达．为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段．并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6；将该质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6转染HEK293细胞．用流式细胞术检测转染pcDNA3．1（＋）-CCR6质粒的HEK293细胞；采用体外趋化实验、钙流实验，验证转染pcDNA3.1（-）．CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段．构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-CCR6：转染HEK293细胞．经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实．表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功．并在HEK293细胞中获得了表达．为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。     

结缔组织生长因子的克隆及其重组腺病毒的构建

目的:克隆结缔组织生长因子(CTGF)及制备表达CTGF基因的重组腺病毒.方法:体外克隆出CTGF并将该基因采用定向克隆的方法克隆进入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,进一步采用同源重组方法将该质粒和腺病毒质粒Adeasy-1连接,然后用脂质体介导的方法导入包装细胞HEK293中产生表达目的基因的重组腺病毒,收集病毒液感染HCT116 wt骨软骨肉瘤细胞,通过荧光显微镜观察GFP和Western Blot检测CTGF蛋白的表达.结果:经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带该基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组腺病毒转染后可使HCT116 wt细胞CT-GF蛋白表达明显增加.结论:成功构建了携带CTGF基因的重组腺病毒载体Ad5-CTGF,为探讨CTGF的作用机制、功能及与相关疾病的发生、发展上的进一步研究打下基础.     

人脂联素受体1和2的真核表达

目的 扩增和表达人脂联素受体1（AdipoR1）和人脂联素受体2（AdipoR2）基因。方法 利用RT-PCR方法扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA。将AdipoR1和AdipoR2的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1。重组质粒转染HEK293细胞。通过免疫荧光技术标记HEK293细胞的AdipoR1和AdipoR2融合蛋白，共聚焦显微镜观察AdipoR1和AdipoR2在细胞中的定位。结果 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-adipoR1和pcDNA3．1-adipoR2．重组质粒转染HEK293细胞后。定位于HEK293细胞膜上。结论 AdipoR1和AdipoR2重组质粒的构建和在HEK293细胞中的成功表达。为进一步研究其与胰岛素抵抗的关系创造了条件。     

人生发中心激酶基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人生发中心激酶（GCK）基因,并构建含有该目的基因的pIRES2-EGFP重组质粒载体,获得稳定表达GCK分子的基因转染细胞。方法采用RT-PCR法从pCMV5-GCK质粒载体上克隆GCK基因,通过双酶切（BglⅡ,SalI）装入pIRES2-EGFP质粒载体中,脂质体法共转染HEK293细胞,24 h后加入G418进行筛选,挑选出能稳定表达GCK蛋白的HEK293细胞株。结果构建了用于表达的含GCK基因的pIRES2-EGFP质粒载体,继而经RT-PCR、Western blot检测筛选出稳定表达人GCK蛋白的HEK293转基因细胞。结论构建了含人GCK基因重组pIRES2-EGFP质粒载体和稳定表达人GCK蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

成纤维细胞生长因子受体FGFR1真核表达质粒的构建及其在HEK293T细胞的表达

目的建立一个有效表达FGFR1的真核系统。方法从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到FGFR1基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构建成pcDNA3.1-FGFR1质粒表达载体,并在HEK293T细胞重组表达;将pcDNA3.1-FGFR1质粒转染HEK293T细胞,通过免疫印迹和免疫荧光检测FGFR1在细胞中的表达情况。结果扩增的FGFR1序列与数据库一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了FGFR1c DNA在HEK293T细胞膜上的表达。结论成功扩增出FGFR1 c DNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了FGFR1在HEK293T细胞的高效表达。     

ARRB1融合蛋白表达载体ARRB1-EGFP的构建及其在神经胶质瘤细胞中的表达

目的 构建重组表达载体ARRB1-EGFP,在细胞中表达与鉴定,为进一步研究其功能奠定基础.方法 RT-PCR获得编码人ARRB1的全基因序列,克隆到真核表达载体pEGFPN1,构建重组表达载体ARRB1-EGFP,并转化于E.coli DH5 α中筛选阳性重组子,通过限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转染人HEK293细胞中表达,表达产物经Western blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光方法比较融合蛋白与内源性ARRB1在SNB19细胞的定位.结果 成功构建了ARRB1融合蛋白的真核表达载体,并经Western blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白与内源性ARRB1定位相似.结论 ARRB1-EGFP融合蛋白可以安全、高效地转导入HEK293以及SNB19细胞中.     

pNTAP-MK2真核表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

目的 构建pNTAP-MK2真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系.方法 将MK2亚克隆至串联亲和纯化载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-MK2,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用脂质体PolyFect介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-MK2融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-MK2的表达及细胞内定位情况.结果 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-MK2主要分布在核内.结论 成功构建pNTAP-MK2真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对MK2定位产生明显影响.     

加温对小白鼠染色体影响的研究

加温是一种对放疗中射线抵抗性细胞增敏的有效方法。加温是否对机体有损伤目前很少有人探讨。本文利用微波辐射、恒温水浴为热源对小白鼠加温,观察细胞染色体的改变,判定热疗过程对机体的损伤。     

100例子宫肌瘤与子宫腺肌病的B超图像分析

目的 探讨子宫肌瘤与子宫腺肌病Ｂ超图像特征及其鉴别诊断。方法 常规Ｂ超检查,并将子宫肌瘤子宫腺肌病两组Ｂ超图像进行比较分析。结果 ４７例肌瘤（９４．０％）有假包膜或界限清楚,。２８例腺肌病（９３．３％）界限欠清;４１例肌瘤（８２．０％）探及栅栏样图像和后方回声衰减仅各有２例（６．６７％）、１８例（６０．０％）呈高回声,两者比较差异有显著性（Ｐ〈０．０１,〈０．０５）。结论：Ｂ超对子宫肌瘤和腺肌病的     

伤立效总提取物对小白鼠骨骼肌微循环障碍的影响

实验表明,伤立效对肾上腺素所致的小白鼠骨骼肌微循环障碍具有扩张微血管口径、加快微血管的血流速度、增加血流量的作用,实验组与对照组比较,各项指标差异均非常显著(P<0.01)。     

手部屈肌腱Ⅱ区损伤的治疗

目的探讨Ⅱ区屈肌腱断裂治疗的有效方法。方法将128例(219指)患者随机分为观察组及对照组。观察组应用显微无创技术对断裂屈指肌腱手术修复、术后早期功能锻炼;对照组采用传统肌腱吻合技术。术后随访6~12个月,采用TAM系统评定法对两组随访资料进行疗效评定。结果观察组:疗效优者60指,良45指,可5指,优良率达95.45%;对照组:疗效优者38指,良52指,可14指,差5指,优良率为82.57%。两组疗效比较有统计学意义(χ2=14.7,P<0.01)。结论应用显微无创技术高质量缝合配合术后早期功能锻炼可有效地预防屈肌腱术后粘连,促进患指功能的恢复。     

甲状腺癌28例误诊原因分析

甲状腺癌误诊的常见原因是对其发病特点认识不足,术前临床资料不■实,术中处理不够慎重。为减少临床误诊应采取综合措施。包括提高对此病诊断的警惕性,认真行颈部触诊,综合分析各项检查结果,依靠穿刺细胞学检查和术中冰冻切片以及石蜡块组织学检查而最后确诊。     

季节性疾病发病高峰期的估计

某些疾病是有季节性的。某些有昼夜变动的周期性或一些角度资料。对这些资料的分析不能用传统的几旬构成比或月旬相对比的方法,应该用圆形分布法进行分析。圆形分布法目前在国内应用尚不多,其应用的原理是通过三角函数的代换,对季节性或周期性资料分布及高峰期所在时间提供较确切的吋点,对疾病的预防和死囚分析可提供科学依据。     

胎儿脏器重量评价胎儿发育状况的分析

目的 探讨胎儿脏器重量与胎儿发育的关系。方法 对２１３例受精龄为１３￣３８周正常胎儿的心、脾重量及体重进行了测量。     

鼻咽癌放疗后复发因素分析（附30例报告）

本文总结了1988－1993年30例鼻咽癌放疗后复发因素，包括剂量因素，边缘因素，病情估计不足及设野不合理等，其中病情估计不足造成的复发，占33．3％（10／30），克服病情估计不足，改进放疗设野布局，有进一步提高鼻咽癌的治愈率和降低复发率的可能，CT检查应列为鼻咽癌的常规检查。     

外阴部血管瘤21例治疗分析

目的：探讨女性外阴血管瘤的治疗方法及时机。方法：对1994-1999年收治的14例女性外阴部血管瘤和7例海绵状血管瘤，分别采用平阳霉素局部注射和手术切除治疗。结果：毛细血管瘤全部治愈，海绵状血管瘤复发率为28.6%(2/7)，1例出现部分皮拉坏死并发症。结论：女性外阴部毛细血管瘤不宜在观察中等其自然消退，应积极采用平阳霉素瘤内注射治疗，海绵状血管瘤单纯用平阳霉素注射治疗效果不佳，宜采用手术切除。     

潍坊地区城市汉族青少年皮下脂肪厚度的调查

①目的 了解山东省潍坊地区城市汉族青少年皮下脂肪发育现状及规律。②方法 对潍坊地区1274名(男649名、女625名)7～19岁城市汉族学生的身高、体质量以及肱三头肌位、肩胛下角位、髂前上棘位和腓肠肌位皮褶厚度进行了测量分析。③结果 皮褶厚度随年龄的变化而变化。女生皮褶厚度大于男生。男女生肱三头肌位皮褶厚度分别在17岁(13．2mm)和18岁(17．7mm)达到高峰；肩胛下角位、髂前上棘位皮褶厚度分别在16岁(13．7mm、13．5mm)和18岁(17．5mm、17．1mm)达到高峰；腓肠肌位皮褶厚度分别在13岁(19．5mm)和14岁(21．4mm)达到高峰。除腓肠肌位皮褶厚度外，其他3项皮褶厚度从10岁起开始出现性别差异。④结论 在生理因素的决定作用下，物质生活水平、体育锻炼等因素影响皮下脂肪的沉积和厚度。