人白介素24基因诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的实验研究

目的:研究人白介素24(hIL-24)在体外诱导宫颈癌Ca Ski细胞凋亡及其作用机制.方法:①以脂质体包裹重组真核表达质粒pcDNA3.1( )-hIL-24转染Ca Ski细胞; ②利用RT-PCR技术检测处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化; ③ Western Blot分析处理后Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平的变化; ④流式细胞仪分析处理后的Ca Ski细胞凋亡情况.结果:处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平下降,抑癌蛋白P53水平增加,细胞凋亡率升高.结论:真核表达载体介导的hIL-24基因体外转染宫颈癌Ca Ski细胞后,能抑制Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的表达,使抑癌蛋白P53恢复活性,促使宫颈癌Ca Ski细胞凋亡.     

人IL-26的基因克隆及其真核表达载体的构建

基因，构建其真核表达载体并探讨在真核细胞中的表达。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA，逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）扩增hIL 26基因；目的片段与pMD18 T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α,菌落PCR、酶切分析和DNA序列分析鉴定重组克隆。用SalⅠ和EcoRⅠ将目的片段切下，插入pIRES2 EGFP的相应位点，构建表达载体pIRES2 EGFP/hIL 26并进行酶切鉴定。将重组质粒用非脂质体试剂Fugene 6转染至COS7细胞中。结果：重组克隆载体pMD18 T/hIL 26内插入片段序列与GenBank上报道的hIL 26基因序列完全一致；pIRES2 EGFP/hIL 26经酶切鉴定与预期结果一致；荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现，Western blotting 鉴定证明hIL 26基因得到了有效表达。结论：成功构建了hIL 26基因的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达。     

重组猪单链IL-12的构建及真核表达

目的克隆猪IL-12(pIL-12)p35和p40亚单位cDNA,构建含有重组猪单链IL-12(pscIL-12)融合基因的真核表达质粒并进行表达。方法分别从正常成年肉猪的外周血单个核细胞(PBMCs)和脾淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR分别获得pIL-12 p35和p40亚单位编码序列的cDNA,应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头(linker)(Gly4Ser)3串联这两个亚基构建融合基因pscIL-12,将融合基因pscIL-12插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过阳离子聚合物介导转染CHO-K1细胞进行表达,RT-PCR鉴定pscIL-12融合基因在真核细胞中的表达。结果所克隆的pIL-12 p35亚基和p40亚基的编码基因序列和构建的融合基因pscIL-12序列均经PCR、酶切、测序得以证实;融合基因pscIL-12在CHO-K1细胞中成功转录。结论成功构建了pcDNA3.1(+)-pscIL-12融合基因的真核表达质粒;pcDNA3.1(+)-pscIL-12在CHO-K1细胞中成功转录,为进一步探讨pscIL-12融合蛋白的生物学活性和疫苗佐剂效应奠定了基础。     

人IL-37b基因真核表达载体的构建与表达

目的：构建pEGFP-N1/IL-37b真核表达载体,并检测其在THP-1细胞中的表达情况。方法：从人PBMCs中提取总RNA,利用RT-qPCR技术扩增出IL-37b基因编码区序列,克隆至pEGFP-N1真核表达载体,将构建的重组质粒pEGFP-N1/IL-37b转染到THP-1细胞中,通过RT-qPCR和Western blot检测IL-37的表达。结果：双酶切及基因测序结果显示 IL-37b基因正确插入真核表达载体pEGFP-N1中;RT-qPCR和Western blot结果显示转染THP-1细胞后,IL-37表达水平明显升高（P＜0.01）。结论：成功构建了新型抗炎因子IL-37真核表达载体pEGFP-N1/IL-37b,为进一步研究IL-37功能及与相关疾病的关系奠定基础。     

人IL-4cDNA的克隆和在COS细胞的表达

将PHA活化的人外周血白细胞cDNA文库同人工合成的人IL-4探针杂交,解离了一段cDNA序列,将它插入πH3M质粒并导入COS猿猴细胞。经FACS测定证实细胞的培养上清中具有人IL-4的生物学活性。     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

人白细胞介素24基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建人白细胞介素24（hIL-24）基因原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达hIL-24蛋白,并测定其生物学活性。方法：用PCR方法从含有hIL-24的质粒中扩增hIL-24 cDNA序列,测序鉴定正确后,应用基因重组技术构建PQE/hIL-24,并转入大肠杆菌(E.coli)M15。IPTG诱导表达目的蛋白,镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析鉴定结果,应用外周血单核细胞（PBMCs）,通过ELESA法分别在48和72 h检测rhIL-24刺激的PBMCs中 IL-6、IFN-γ及TNF-α产生情况。结果：获得与GenBank中报道一致的hIL-24基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,获得具有hIL-24免疫原性、相对分子质量约为18 400目的蛋白。Ni²⁺-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白, 获得rhIL-24蛋白刺激的PBMCs,PBMCs分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平显著高于未刺激前分泌水平(P<0.05),rhIL-24具有与天然hIL-24蛋白相同的生物学活性。结论 成功地构建了hIL-24的原核表达载体,在E.coli中高效表达了rhIL-24蛋白,获得了与天然hIL-24蛋白具有相同生物学活性的rhIL-24。     

人AFP全长基因编码序列的克隆及表达

目的 构建人AFP全长基因编码序列的真核表达质粒,并在CHO及小鼠肌肉组织中表达。方法 从人胎肝组织中提取AFP基因,以全长基因序列为目的基因片段,真核表达质粒pcDNA3．1( )为载体,构建AFP重组质粒phAFP,经酶切分析和DNA测序对phAFP进行鉴定。重组质粒phAFP经脂质体转染真核细胞CHO以及直接注射小鼠胫前肌,并采用免疫荧光染色及免疫组化对其表达产物进行检测。结果 获取的AFP基因片段与GenBank报道的序列一致,确认为人AFP基因的全长编码序列,构建的重组质粒phAFP能在体外真核细胞CHO、体内肌细胞中有效表达。结论 成功构建了能在真核细胞中表达的重组质粒phAFP,为AFP DNA疫苗治疗肝癌的研究打下基础。     

前列腺特异膜抗原基因的克隆和真核表达

[目的]克隆前列腺特异膜抗原(PSMA)基因的编码区序列,并进行真核表达.[方法]用RT-PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMA cDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0.用脂质体转染法,把pcDNA3.0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达.[结果]序列测定结果表明,两条引物之间的片段长度为2 279 bp,与预期长度一致.将克隆的编码区序列与GenBank的PSMA序列进行Blast对比分析,同源性为99.7%;间接免疫荧光法显示表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的相对分子质量为100 ku.[结论]成功扩增了PSMA编码区序列,构建了PSMA真核表达载体,建立了PSMA稳定表达的细胞株.经免疫分析,证实了真核细胞内表达的PSMA为分子质量正确的膜蛋白,且具有良好的抗原性.所获得的PSMA真核表达系统为进一步研究PSMA基因修饰的DCs疫苗对前列腺癌的治疗提供了物质基础.     

未知基因CGI-100的克隆及其真核表达载体的构建

目的:为探讨研究未知基因CGI-100的功能,克隆人CGI-100基因并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从人白血病K562细胞中克隆CGI-100基因全长编码区,将该cDNA片段亚克隆至载体pMD18-T SimpleT中,经测序鉴定后,用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切将目的cDNA片段定向克隆至相同处理的pIRES2-EGFP真核表达质粒中,然后经酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定.结果:经酶切、PCR及测序鉴定证实,CGI-100基因全长编码区cDNA被准确正向插入至pIRES2-EGFP质粒的酶切位点BamH Ⅰ和Pst Ⅰ之间,未发现碱基突变或移位.结论:成功地构建并鉴定了含CGI-100基因全长编码区的真核表达质粒,为以后研究该基因的功能奠定了基础.     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及其在细胞中的表达

目的构建人淋巴细胞趋化因子(human lymphotactin，hLpm)真核表达质粒，并在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中的表达重组质粒。方法用RT—PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hLpm的含编码区序列的cDNA，克隆至pGM—T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcD—NA3．1( )-hLpm，用脂质体将其转染BIU-87细胞，经G418筛选稳定表达克隆，用免疫荧光染色技术鉴定经筛选的克隆。结果克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同．系同义突变；构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-hLptn；筛选获得了稳定表达转染hLpm的BIU-87细胞株。结论成功构建的hLpm真核表述系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中稳定表达，为研究hLpm基因介导的人膀胱肿瘤特异性主动免疫治疗奠定了基础。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达。方法采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达。结果构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×10³的融合蛋白。结论成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础。     

人UROC28基因真核表达载体的构建

目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达。方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因。重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况。结果:PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致。证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcD-NA3中。Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞24 h后有UROC28的表达。结论:成功构建了pcD-NA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。     

结缔组织生长因子的克隆及其真核表达载体的构建

目的结缔组织生长因子(CTGF)在肿瘤发生,胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖和分化、血管形成等众多领域都有着重要的作用,对结缔组织生长因子进行克隆及构建其真核表达载体,对其在功能上的进一步研究及应用有积极意义.方法以含有鼠CTGF基因序列的EST克隆为模板,通过PCR的方法克隆出目的基因CTGF,再以分子克隆学的方法将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV,进一步以PCR、酶切、DNA测序的方法筛选出正确的真核表达质粒.并通过Western-Blotting的方法对质粒的表达功能进行研究.结果 PCR、酶切、DNA测序的方法均证实已经成功克隆获得序列正确的目的基因CTGF,并将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV.Western-Blotting的结果表明构建的表达CTGF的真核表达载体高表达CTGF蛋白质.结论成功克隆目的基因CTGF并构建其真核表达质粒,证实在蛋白质水平获得了表达.     

Ad-IL-24抑制乳腺癌生长的体外实验研究

目的 研究腺病毒介导的IL-24基因(Ad-IL-24)表达对乳腺癌的生长抑制作用.方法 将扩增的Ad-IL-24腺病毒感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,用RT-PCR法、Westernblot法检测IL-24基因在肿瘤细胞中的转录和表达;MTT法和FCM检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的生长抑制和凋亡率;半定量RT-PCR检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的凋亡相关基因Bax、Bcl-2及Survivin转录的影响;ELISA法检测VEGF、Ang-1的分泌水平.结果 IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达,并对乳腺癌细胞增殖有明显抑制作用,并能引起细胞凋亡,其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值升高、Survivin降低有关;VEGF、Ang-1表达下降.结论 腺病毒介导的IL-24基因在体外可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长,诱导其凋亡,其机制可能与下调Survivin、VEGF、Ang-1,上调Bax的基因表达水平有关,该研究可为乳腺癌的基因治疗提供一定实验依据.     

碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的真核表达载体,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法：①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增bFGF基因;②将bFGFDNA克隆到pGEM-TEasy质粒,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定;③然后将bFGF DNA亚克隆到pEGFP-N3质粒;通过抗性基因筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果：菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论：经RT-PCR反应得到了特异的bFGF基因片段并成功构建了bF-GF荧光真核表达载体。     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体的构建与研究

目的构建全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体p EGFP N1/IL-37b,检测二者在RAW 264.7细胞中的表达情况。方法以含IL-37b全长编码区基因的质粒p UBC/IL-37b为模板,构建能够表达全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体。将构建的重组质粒p EGFP N1/IL-37b转染到RAW 264.7细胞中,通过western blot和共聚焦显微镜检测全长与成熟形式的IL-37b的表达情况,并通过real-time PCR检测全长与成熟形式IL-37b对LPS诱导的IL-6表达的抑制作用。结果构建的p EGFP N1/IL-37b转染后能够在细胞中表达全长与成熟形式的IL-37b,并且能够抑制LPS诱导的IL-6的表达。结论成功构建了全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体,为进一步研究IL-37b的炎症抑制作用与机制打好基础。