新型甲型H1N1流感病毒深圳分离株HA基因的克隆与进化

目的 分析2009年新型甲型H1N1流感病毒深圳分离株A/Shenzhen/71/09血凝素(Hemagglufinin,HA)基因序列,探讨其基因变异与分子进化.方法 采用RT-PCR技术扩增A/Shenzhen/71/09 HA基因片段并进行测序,利用Cluster和Mega3.1软件对不同亚型毒株HA基因核苷酸序列进行分析,绘制发育进化树. 结果 A/Shenzhen/71/09毒株HA基因包含HA1和HA2两个片段,长度分别约为1 032bp和669bp,HA蛋白裂解位点为VPSIQSR↓ GLF,不含连续碱性氨基酸.进化分析表明该病毒株与其它亚型病毒株遗传距离较远,而与深圳地区同期分离的其它H1N1毒株高度同源,同源性在99.0％以上.结论 新型甲型H1N1流感病毒HA基因不具备高致病流感病毒序列特征,深圳地区同期分离的毒株变异率低,但仍需密切关注新型甲型流感的传播情况.     

新型甲型H_1N_1流感毒株NA基因特征和进化

目的 通过对新型甲型H1N1流感毒株神经氨酸酶(NA)基因序列的变异分析,揭示毒株NA基因变异与进化.方法 检测广东地区分离毒株NA基因核苷酸序列,同时对全球新型甲型H1N1流感毒株NA基因进行检索下载,采用Lasergene 7.1软件比对和分析NA基因核苷酸和氨基酸序列,结合临床资料分析变异基因进化,同时分析糖基化位点.结果 2009年4-12月69株毒株NA基因16个氨基酸位点置换,占3.41%(16/469);NA蛋白主要置换位点在V106I/H和N248D.毒株GD-801-2009(H1N1)和GD-1202-2009的NA基因明显受到的感染宿主选择性作用,而毒株GD-1-2009的NA基因明显受到的感染宿主负选择性作用.与毒株GD-1-2006(H5N1) NA基因比较,毒株GD-801-2009的NA基因插入Nt145-204,导致H1N1 NA蛋白增加第49~68位氨基酸(CNQSVITYENNTWVNQTYVN),其中包括4个糖基化位点.结论 广东新型甲型H1N1流感毒株NA基因正向不同方向进化;新型甲型H1N1流感NA蛋白新增4个糖基化位点.     

江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素和神经氨酸酶分子特征分析

目的:分析江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)变异情况,分析其遗传进化特征?方法:按照流感样病例定义,收集江苏省各哨点医院流感样病例标本,阳性样本经病毒分离培养及亚型鉴定?选取2013年不同时间段?不同地区具有代表性的14株甲型H1N1(09pdm)阳性毒株,利用特异性引物扩增HA?NA基因,测序并分析其遗传进化特征?结果:14株分离毒株与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)的HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%~98.4%和96.5%~98.0%?NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%~98.9%和97.0%~98.5%?遗传进化分析表明,14株分离株HA和NA基因分属于不同的进化谱系?分子特征表现为HA氨基酸序列出现D114N?K300E?E516K的变异,NA分子特征表现为N44S位点变异?从2013年左右开始甲型H1N1(09pdm)流感基因多样性增加;通过FEL模型得到一个正向压力选择HA氨基酸位点310,一个正向压力选择NA氨基酸位点4,通过REL模型得到9个正向压力选择HA氨基酸位点179?180?239?301?303?310?311?312?313(含位点310),5个正向压力选择NA氨基酸位点4?23?52?287?374(含位点4)?HA蛋白具有9个潜在糖基化位点,7个位于HA1上,2个位于HA2上;NA蛋白共有9个潜在糖基化位点?14株分离毒株在NA蛋白酶活性中心及周围辅助位点上均未发现变异?结论:2013年江苏省甲型H1N1(09pdm)流感HA?NA基因变异加快,遗传多样性增加,未来的遗传进化值得进一步关注?     

2000～2009年H1N1甲型流感病毒血凝素基因HA1的演变特征

目的研究2000～2009年世界各地不同物种的新型H1N1流感病毒HA1基因演变特征。方法从NCBI数据库下载所需序列,采用生物信息软件对其氨基酸序列进行基因特性分析以及构建种系发生树。结果病毒株HA1基因抗原决定簇和多个受体结合位点发生变异,并且新型病毒与猪H1N1流感病毒在大多数变异位点的氨基酸相同。结论新型毒株HA1基因可能由早期来自北美洲的H1N1猪流感病毒进化而来,在进化过程中,一些重要位点的变异导致HA1基因发生抗原性变异,从而导致流感的大爆发。     

中国2009年甲型H1N1流感病毒进化分析

目的研究2009年中国甲型H1N1流感病毒的进化特性和变异情况,为甲型H1N1流感的监控和防治提供科学依据。方法利用ClustaX进行序列比对,以Bioedit软件进行序列同源性分析,使用Mega 4.0软件采用邻位相连算法构建进化树,对2009年登录在Genbank数据库中的中国甲型H1N1流感病毒的HA、NA、M蛋白的氨基酸序列进行系统进化分析。结果中国2009年甲型H1N1流感病毒分离株与美国分离株[A/California/04/2009（H1N1）]具有很近的亲缘关系,不同省份分离株之间的HA、NA、M蛋白相互交叉渗透,但同时各个省份间暴发的H1N1流感病毒的HA蛋白又具有一定的聚集性。香港分离株[A/Hong Kong/2369/2009（H1N1）]和上海分离株[A/Shanghai/LWS1/2009（H1N1）]产生了对达菲的耐药性,其他毒株仍然敏感;上海分离株[A/Shanghai/LWS1/2009（H1N1）]对金刚烷胺类药物敏感,其余毒株均对其耐药。结论本研究表明,中国2009年甲型H1N1流感病毒不仅具有很强的保守性,同时又具有一定的区域特异性,毒株相对稳定,没有出现大的变异。     

福州2009-2014年甲型H1N1流感病毒株HA基因进化分析

目的:分析福州地区2009-2014年甲型H1N1流感病毒株的HA基因序列和遗传特征。方法:采集流感样病例的咽拭子标本,用MDCK细胞培养法和Real-time RT-PCR法对6株分别来自2009-2014年的病毒株进行病毒分离、鉴定,HA基因片段通过RT-PCR法进行扩增后克隆到p MD18-T载体上,并测定6株病毒株的HA基因序列。通过生物软件Bio Edit对该分离株和Gen Bank中相关毒株的序列进行基因进化树分析。结果:6株分离株的HA基因推导氨基酸序列与参考株A/California/04/2009相比,2009-2014年HA1区氨基酸发生了突变,主要是位于136、145、188、189、192和193位点。结论:近几年,福州地区H1N1流感的HA基因序列与世界流行的病毒参考株具有高度同源性,并多处氨基酸发生替换而产生抗原性漂移。     

2004-2005年宁夏A(H1N1)亚型流感病毒基因特性研究

目的了解宁夏流行的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素基因变异情况。方法对分离的A(H1N1)亚型毒株随机选取5株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。结果HA1区核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,宁夏2004年分离到的A(H1N1)亚型流感病毒株有以下位点发生变异,35 D>N、152 G>R、182 P>S、221 D>G,其中152、221位氨基酸位于抗原决定簇;2005年分离到的A(H1N1)亚型流感病毒株有以下位点发生变异,82 T>K、94 Y>H、119 K>N、145 R>K、165 V>A、208 R>K、251W>R、266 T>N,其中165位氨基酸位于抗原决定簇。结论宁夏2004-2005年分离的A(H lN1)亚型流感毒株基因特性和抗原性已开始发生变异。     

2008～2009年南宁市季节性H1N1亚型流感病毒血凝素HA1基因变异分析

目的分析南宁市2008～2009年度流行性感冒的病原学监测结果,探讨其季节性H1N1亚型流感病流行情况和HA1基因变异规律及进化趋势。方法根据流感病原学监测和疫情挑选2008～2009年中分离到的季节性H1N1亚型毒株20株(每年10株),提取病毒RNA,采用RT-PCR扩增病毒HA基因后进行核苷酸序列测定,利用VectorNTI 9.0分析处理,并与WHO推荐疫苗株进行比对,用Mage 4.1构建系统进化树。结果 2008～2009年南宁市季节性流感流行主要集中在夏秋季节,H1N1成为2008年度的优势毒株。进化树分析表明,南宁市2008～2009年毒株被分为2个分支(Ⅰ和Ⅱ),A/Solomon/3/2006和A/Brisbane/59/2007分别分布在分支Ⅰ和Ⅱ内。对H1N1HA1氨基酸序列分析表明,20份毒株二硫键和糖基化位点比较保守,受体结合位点(RBS)和抗原决定簇位点相对活跃,其中RBS 188、189、222、224均发生了不同程度的变异。与A/Solomon/3/2006相比,2008年毒株抗原决定簇存在4个氨基酸的替换并且分布在两个抗原决定簇区域,2009年毒株除A/nanning/473/2009外,抗原决定簇区氨基酸变异未达到4个。结论南宁市2009年H1N1流感病毒HA1基因特性与A/Brisbane/59/2007疫苗株接近,2008年毒株与两疫苗株相比变异较大,这可能是导致2008年南宁市H1N1亚型流感病毒流行强度明显增加的原因。     

福州市甲型H1N1流感病毒血凝素基因遗传特性研究

目的探究福州市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因的遗传变异特点及种系进化分布,为研究甲型H1N1流感病毒进化、致病性和流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞培养法和real-time PCR法进行流感病毒分离、鉴定。采用逆转录-聚合酶链反应扩增流感病毒血凝素基因,扩增产物经纯化后,进行血凝素基因HA区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后用DNASTAR MegAlign序列分析软件进行基因种系进化特性分析。结果福州市甲型H1N1流感病毒与参考株A/California/04/2009相比具有高度同源性,HA蛋白有4个位点氨基酸发生了替换,与猪流感代表株A/swine/Iowa/15/1930(H1N1)存在6个HA抗原决定簇位点变异。福州市甲型H1N1流感病毒株都有8个糖基化位点,其中6个位于HA1区,分离株HA蛋白不具有多碱基裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与美国流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株共聚类为一个独立的小分支,进化关系最近,甲型H1N1流感病毒的HA源于古典型猪H1N1流感病毒,与A/swine/Iowa/1/1976(H1...     

2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况。方法:从NCBI基因库检索获得43株不同年代不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA 4.0）软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析。结果:2009年新型甲型H1N1流感病毒与禽H5N1流感病毒NA基因的同源性达到85％,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点高度保守,但糖基化位点有变异。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA基因可能来源于禽H5N1流感病毒;神经氨酸酶抑制剂治疗有效。     

2009—2010年广州甲型H1N1流感的流行特征分析

目的分析甲型H1N1流感在广州的流行特征。方法 2009年5月至2010年4月,每周分别从广州四家监测医院采集流感样症状患者的嗽口液或咽拭子,采用real-time PCR方法鉴定甲型H1N1流感病毒;在广州5大城区采集不同年龄的人群血清,通过血凝抑制实验检测血清中甲型H1N1流感抗体;对其时间和年龄的分层进行分析。结果全年共采集嗽口液或咽拭子3580份,甲型H1N1流感核酸检测阳性530份,阳性率为14.8%,阳性率最高的月份出现在10～12月,为36.5%～42.3%,阳性率最高的年龄组为5～岁和15～岁组,为18.5%和24.2%,最低的年龄组为≥60岁组,为4.1%。人群血清标本共采集1527份,甲型H1N1流感抗体阳性439份,阳性率为28.7%,阳性率最高的年龄组为5～岁和15～岁组,为36.1%和39.5%,最低的年龄组为≥60岁组,为8.6%。结论甲型H1N1流感的流行期发生在10～12月,流行时间短,感染的主要人群是学龄组人群,而老年人群的感染率相对较低。预防流感的工作重点应放在学校内。     

2009～2010年深圳市福田区甲型H1N1流感病毒监测分析

目的检测深圳市福田区2009-2010年流感监测样本,分析甲型H1N1流感病毒的流行病学特点。方法采用实时荧光定量（Real Time RT-PCR）进行核酸检测和型别鉴定,同时进行病毒分离和血凝实验。结果 2009年8月-2010年12月共检测467份咽拭子样品,核酸检测阳性129份,阳性率为27.62%;病毒分离毒株101株,阳性率为21.63%。结论在2009年8月份甲型H1N1流感开始流行并成为流行的优势毒株,并持续到2010年3月份;5～59年龄人群甲型H1N1流感病毒分离率较高,而5岁以下及≥60岁年龄组分离率反而较低。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲（A）型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系。方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列。结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976~2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低。不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感。     

335例甲型H1N1流感病例流行病学分析

目的 探讨甲型H1N1流感的流行病学特征.方法 回顾性分析2009年6月至2010年1月确诊的335例甲型H1N1流感患者的流行病学资料,分析普通型与危-重型患者的流行病学特点.结果 2009年10月前患者多有甲型H1N1流感接触史,病情轻;2009年11月至2010年1月患者少有甲型H1N1流感接触史,危-重型患者增...     

重庆市2009～2014年甲型 H1N1流感病毒分离株 HA基因变异分析

目的：对2009～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行血凝素（HA）基因测序分析,与世界卫生组织（WHO）推荐疫苗株A／California／07／2009（H1N1）比对,研究其基因变异情况。方法按分离时间及地点不同,选取47株2011～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行测序,同时选取既往已有的25株2009年甲型H1N1流感病毒的序列结果,经分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树。结果2009、2011～2014年的新型甲型 H1N1流感病毒与疫苗株均位于一个大的分枝下,各病毒间的关系均较近。72株分离株的 H A基因总的核苷酸差异在0～2．7％之间,氨基酸差异在0～3．1％之间;与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）的核苷酸差异在0．4％～2．4％之间,氨基酸差异在0．9％～3．1％之间。氨基酸变异情况随着年份增加累积得更多,但在氨基酸序列上仍显示为低致病性流感病毒特征;2009年有9株病毒株丢失481位的糖基化位点,2013年有6株病毒株增加位于162位的糖基化位点。结论 WHO推荐的甲型 H1N1疫苗总体上对重庆地区的人群仍有较好的保护作用,但随着时间推移,部分甲型 H1N1流感病毒株可能已发生抗原漂移,需继续对其监测。     

2010年青海省流感病毒病原学监测及H3亚型HA1基因序列分析

目的监测青海省2010年季节性流感病毒型与亚型分布,并了解2010年部分A/H3N2分离株血凝素(HA)基因变异情况。方法采集全省各监测哨点医院鼻咽双拭子标本,接种MDCK细胞,采用标准抗血清鉴定阳性分离株型与亚型,并对2010年部分H3亚型流感病毒进行HA基因测序,分析HA基因变异情况。结果2010年全省哨点医院送检标本中共分离63株流感病毒,其中42株为A/H3N2,B型15株,AH1N1流感病毒6株,型与亚型有明显分布强弱特征。选取10株H3N2亚型分离株进行HA序列分析,发现与同期南京分离株接近,与WHO2010年度疫苗推荐株相距甚远,不在同一分支。结论 2010年青海省流行的H3N2亚型流感病毒的抗原性和基因特性发生了改变。     

甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法的建立

目的构建一种可同时检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法根据不同流感亚型HA与NA的差异,设计五对引物及五条探针,构建合适的检测体系,分析特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,并将其与常用检测试剂盒进行比对。结果本研究成功构建多重荧光RT-PCR检测体系,能同时检出甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒,检测灵敏度为101~102拷贝/μl,可重复性好(变异系数为0.47%~4.03%),比常用检测试剂具有更好的荧光值水平,可适用于多种常见的荧光定量PCR仪。结论本方法所构建检测流感亚型体系具有较好的特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,适用于各基层疾控及医疗机构。     

深圳地区新甲型H1N1（2009）流感病毒M基因特征分析

目的对深圳地区分离到的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因分子特性进行详细分析,并从分子水平上了解其对金刚烷胺类药物的耐药性。方法选取深圳地区分离培养到的55株新甲型H1N1（2009）流感病毒,对其M片段进行全长测序,采用DNAstar与MEGA3．1生物软件对M基因序列进行比对并用NJ法构建系统进化树。结果通过对M基因的氨基酸序列进行进化分析,发现深圳地区分离培养到的新甲型H1N1（2009）流感病毒更接近欧洲猪流感病毒,与季节性HINI流感病毒差异很大。经过序列分析发现,深圳株的M基因与A／California／07／2009高度同源,显示该病毒M基因较保守。此外,还发现所有深圳株的M2蛋白均出现s31N突变,显示对金刚烷胺类药物可能耐药。结论深圳流行的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因可能源于欧洲猪流感病毒,且均对金刚烷胺类药物有耐药倾向。应进一步加强对新甲型H1N1（2009）流感病毒的分子特征研究,并积极开展流感病毒耐药性监测。