HSP70 siRNA对宫颈癌HeLa细胞HSP70表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的通过体外实验观察HSP70的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞株增殖及凋亡的影响,探讨HSP70在HeLa细胞增殖和凋亡中的功能。方法针对HSP70基因设计siRNA序列,克隆到空载体pTZU6+1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。在脂质体2000的介导下转染HeLa细胞,同时转染空载体为阴性对照及不加任何试剂的空白对照。转染48h后,应用半定量RT-PCR,Westernblot检测HeLa细胞HSP70mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测HeLa细胞的生长抑制率;AO/EB染色法观察HeLa细胞形态学变化;流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率和细胞周期分布情况。结果与对照组相比,转染pHSP70-siRNA组HSP70的mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.01),表明Phsp70-siRNA质粒转染能有效降低HSP70的表达;细胞生长抑制率明显增高(P<0.05),且在48h时细胞抑制率达到最大;在荧光显微镜下观察到HeLa细胞出现凋亡形态;流式细胞术结果显示pHSP70-siRNA组细胞凋亡率显著高于对照组,且G0/...     

Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA序列(CDS),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GFP-Pin1蛋白的表达。结果RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌HeLa细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GFP-Pin1蛋白高表达;经G418筛选获得单细胞克隆。结论重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。     

可诱导的shRNAs表达系统对HeLa细胞SMYD3基因表达的抑制

目的:探讨可诱导的shRNAs表达载体介导的RNA干扰技术对HeLa细胞SMYD3基因的抑制作用。方法:设计和构建由强力霉素调控产生针对SMYD3基因的shRNAs表达质粒,转染至HeLa细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,RT-PCR检测SMYD3基因的表达,MTT法检测对细胞增殖的影响。结果:酶切鉴定、测序分析证实shRNAs表达质粒构建成功。转染HeLa细胞后,在强力霉素诱导下,受到特异SMYD3 shRNAs干扰的HeLa细胞发生了典型的凋亡形态学改变。同时SMYD3 mRNA表达下调,细胞生长受抑制。而阴性对照组和空白对照组无明显变化。结论:针对SMYD3基因的可诱导的shRNAs表达质粒转染HeLa细胞后,在强力霉素的作用下,可阻断SMYD3基因的表达,抑制HeLa细胞的增殖,并能诱导HeLa细胞凋亡。     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.     

稳定干扰NOR1基因对HeLa细胞的影响

目的：研究稳定干扰NOR1 基因对宫颈癌HeLa细胞系的影响。方法：采用pSUPER.neo+GFP载体构建靶 向NOR1基因的shRNA干扰载体pSUPER-shNOR1-1,pSUPER-shNOR1-2以及无关序列对照载体pSUPER-scramble,通过 脂质体转染HeLa细胞,经G418筛选获得稳定干扰细胞系。采用RT-PCR 和Western 印迹检测NOR1 mRNA和蛋白表达 水平。采用MTT法测定细胞生长曲线。采用H2O2处理HeLa细胞,采用Hoechst 33258染色和TUNEL法测定细胞凋亡。 Western印迹检测干扰NOR1对HeLa细胞凋亡相关分子Bcl-2,caspase和聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)表达的影响。结果：稳定感染的shRNA干扰载体pSUPER-shNOR1-1和pSUPER-shNOR1-2抑制了HeLa细胞内源性 NOR1的基因表达,成功构建了稳定干扰NOR1基因的HeLa细胞系。M生长曲线测定表明：与pSUPER-scramble质粒 转染细胞相比,稳定转染pSUPER-shNOR1-1和pSUPER-shNOR1-2质粒促进了HeLa细胞的活力和增殖,并抑制了H2O2 诱导的HeLa细胞凋亡。Western印迹检测发现稳定干扰NOR1抑制了H2O2诱导的HeLa细胞caspase 9和PARP的活化,上调 了Bcl-2蛋白的表达。结论：稳定干扰NOR1 基因促进了HeLa细胞的活力与生长,并抑制了H2O2诱导的细胞凋亡,其 机制与干扰NOR1表达引起抗凋亡分子Bcl-2表达增加和抑制caspase 9活化有关。     

核仁素表达下调对宫颈癌细胞Hela生物学行为的影响

目的 探讨核仁素表达下调对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响。方法 实验分4组：3个靶向人核仁素基因的实验组(siN1组、siN2组、siN3组)及1个阴性对照组(NC组)。体外化学合成各组siRNA并转染HeLa细胞;利用荧光实时定量RT-PCR法和Western blotting法分别从mRNA和蛋白水平检测核仁素基因的干扰效率,并筛选出干扰效率最高的片段;利用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测核仁素下调对HeLa细胞增殖活性的影响;利用流式细胞学Annexin V-FITC检测转染后HeLa细胞凋亡率的改变;Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变。结果 与NC组相比,各实验组核仁素mRNA表达水平均下降(P<0.05);蛋白表达水平也相应下调(P<0.05)。成功筛选出最佳干扰片段siN2,用于后续实验。siN2组HeLa细胞生长速率明显受到抑制(P<0.05);流式细胞学Annexin V-FITC检测siN2组HeLa细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.05);Transwell实验显示siN2组HeLa细胞侵袭能力减弱(P<0.05)。结论 核仁素表达下调明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭能力,促进细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了理论依据。     

辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL的构建及其对肿瘤细胞的体外诱导凋亡作用

目的：构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（hTRAIL）基因的辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL,并研究其在人肺腺癌细胞株A549中的表达及促凋亡作用。 方法：采用常规分子生物学方法构建表达质粒pEgr-hTRAIL,体外通过脂质体转染A549细胞,经G418筛选稳定转染细胞A549-shTRAIL,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测目的基因的表达,采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡。 结果：经限制性内切酶酶切鉴定pEgr-hTRAIL表达质粒构建正确;稳定转染细胞A549-shTRAIL的hTRAIL mRNA表达量明显增加;稳定转染细胞A549-shTRAIL的凋亡细胞百分数明显增加,是A549细胞的1.8倍（P<0.05）。 结论：成功构建pEgr-hTRAIL表达质粒,体外稳定转染细胞A549-shTRAIL具有明显诱导凋亡作用。     

Twist shRNA对人宫颈癌细胞体外黏附、铺展及迁移能力的影响

目的通过RNA干扰抑制Twist基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达,观察Twist基因沉默对HeLa细胞体外黏附、铺展及迁移能力的影响。方法根据shRNA设计原则,构建两种靶向Twist基因的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒,稳定转染HeLa细胞。通过荧光定量PCR及Western印迹法检测HeLa细胞中Twist基因mRNA和蛋白的表达水平,利用黏附实验、铺展实验和划痕实验检测其对细胞黏附力和迁移力的影响。结果成功构建的Twist shRNA真核表达载体稳定转染HeLa细胞后可显著降低Twist基因的表达。与对照组相比,Twist基因沉默组细胞的黏附、铺展及迁移能力明显下降（P〈0.05）。结论成功构建的Twist shRNA真核表达载体,能有效抑制HeLa细胞黏附、铺展及迁移能力。     

RNAi沉默HSP70基因对宫颈癌HeLa细胞的影响

目的:本研究初步探讨RNAi技术应用于宫颈癌基因治疗的特异性及其作用机理。方法:设计靶向HSP70基因siRNA序列,构建重组表达载体pTZU6+1-siRNA-HSP70,在脂质体介导下瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,在体外诱导RNAi沉默HSP70基因,同时设转染空载体pTZU6+1为阴性对照组和不加任何试剂的空白对照组。采用RT-PCR和Western blotting方法检测实验组和对照组中HSP70表达;MTT法检测细胞生长与增殖;流式细胞术检测细胞的凋亡率和细胞周期分布。结果:与对照组相比,实验组转染HeLa细胞后,细胞的HSP70 mRNA和蛋白表达均明显下调(P<0.01);细胞生长抑制率增高(P<0.05);细胞周期相分布发生变化。结论:siRNA明显抑制HSP70的表达及宫颈癌HeLa细胞的增殖,并引起细胞凋亡和细胞周期改变,为进一步研究HSP70基因在宫颈癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

RNA干扰抑制CD59对非小细胞肺癌GLC-P细胞株增殖的影响

目的运用RNAi技术抑制CD59基因的表达,观察其对非小细胞肺癌细胞株GLC-P增值、凋亡的影响。方法合成可抑
制CD59基因的片段,并运用RNA干扰技术,构建重组质粒,通过脂质体转染法将重组质粒转染至非小细胞肺癌细胞株GLC-P,
并筛选出稳定表达细胞后,采用PCR、MTT、ELISA 法检测该稳定表达细胞株的增值、凋亡所受到的影响。结果干扰后的
GLC-P细胞株中CD59 mRNA表达量较未干扰组显著降低（P<0.05）,同时MTT、ELISA实验检测显示肺癌GLC-P细胞增殖能
力降低,可诱导肺癌细胞的凋亡。结论肺癌患者肿瘤细胞中存在CD59高表达,抑制CD59基因表达的同时可抑制GLC-P细
胞的增殖能力并诱导细胞凋亡,为非小细胞肺癌的靶向治疗提供了新靶点、新思路。
     

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。     

人增生性瘢痕成纤维细胞IKKβ特异性siRNA表达载体构建及表达

目的：体外合成并筛选人增生性瘢痕成纤维细胞特异性IKKβ-siRNA,构建其表达载体并检测其表达.方法：化学合成3条IKKβ-siRNA,分别转染体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,采用RT-Q-PCR筛选出特异性IKKβ-siRNA,并采用PU6质粒构建载体,RT-Q-PCR检测其表达.结果：合成的3条IKKβ-siRNA链中,仅第二条有明显抑制IKKβ的mRNA表达的作用,并通过酶切鉴定和测序结果证明成功构建IKKβ-siRNA载体,经转染靶向IKKβ-siRNA的成纤维细胞,IKKβ的表达在转染后24h及48h均受到抑制.结论：应用RT-PCR可筛选出针对人增生性瘢痕成纤维细胞的特异性IKKβ-siRNA;可构建具有干扰效果的IKKβ-siRNA表达载体,转染后可以降低IKKβ的表达.     

HPV16 E7"自杀性"DNA 疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的"自杀性"DNA疫苗,并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32/E7质粒为模板,用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建真核表达重组质粒pSCA/E7,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转染BHK-21细胞,然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达,用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400 bp的目的基因片段,测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100%同源。免疫荧光技术检测证实,pSCA/E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实,pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA/E7,该重组质粒可在BHK-21细胞中表达,并能诱导被转染的细胞发生凋亡。     

Ang2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siR-NA慢病毒转移质粒,再以pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白包膜质粒和包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,证明Ang2-siRNA核苷酸序列插入的正确性。利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Ang2基因的RNAi慢病毒表达载体,为下一步进行干扰体内外恶性黑素瘤Ang2的表达奠定基础。     

姜黄素诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其作用机制的研究

目的:研究姜黄素在体外诱导宫颈癌H eL a细胞凋亡及其作用机制。方法:3H-脱氧胸苷掺入法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR检测HPV E 6的mRNA水平表达;W estern b lot检测细胞凋亡相关基因bcl-2、bax、P 53和P 21ras的蛋白水平表达。结果:姜黄素对H eL a细胞生长有抑制作用,并呈剂量依赖性;流式细胞仪和荧光双染法结果提示姜黄素可诱导H eL a细胞凋亡;RT-PCR提示姜黄素作用H eL a细胞后HPV E 6的mRNA水平表达逐渐降低;W estern b lot结果提示姜黄素能上调B ax、P 53和P 21ras的蛋白水平表达,而B cl-2的表达无明显影响。结论:姜黄素通过抑制HPV E 6的表达,恢复P 53的功能,引起细胞凋亡,起到杀伤肿瘤的作用。     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

siRNA介导的MAPKp42沉默诱导HeLa细胞凋亡

目的应用siRNA沉默HeLa细胞MAPKp42，研究其对细胞存活的影响。方法体外合成靶向MAPKp42的siRNA-1和siRNA-2，并用脂质体转染HeLa细胞，Western印迹法和免疫组织化学法检测p42^MPAK的表达；电镜观察，TUNEL法测定细胞凋亡，Annexin-PI法测定不同凋亡时期细胞的分布。结果siRNA-1和siRNA-2均可使HeLa细胞MAPK p42沉默，使p42^MAPK表达下调，与阴性对照组相比分别降低2、5倍和3．2倍。电镜观察证实，siRNA-1和siRNA-2转染组部分细胞丧失表面微绒毛，细胞内空泡增加，细胞核染色质边集。处理组HeLa细胞早期凋亡率显著增加，其中siRNA-1组晚期凋亡率也明显增加。结论siRNA介导的MAPKp42沉默可以诱导HeLa细胞凋亡。     

siRNA表达载体对hTERT基因的效应评价

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰表达载体,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达的影响。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列并构建重组siRNA表达载体pGenesil-hTERT。酶切测序鉴定后,脂质体转染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Weston Blot法检测hTERT基因的表达情况,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功,且转染MCF-7细胞后,hTERT mRNA和蛋白质表达水平显著抑制,细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。结论:以DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞生长、促进细胞凋亡。     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株?方法:设计3个单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),分别靶向OSBPL2基因的第2?3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体?分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,CruiserTM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率?选出靶向效率最高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,最后用Western blot 鉴定敲除效果?结果:sgRNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达?结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功?