重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化

目的：构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1( rhKGF1_dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法：利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1_dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1_dest23﹑pET22b-sumo-rhKGF1_dest23﹑pET3c-rhKGF1_dest23和pET3c-sumo-rhKGF1_dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3) plysS、BL21(DE3) 、BL21(DE3)Star plysS、origima(DE3) 和BL21AI,筛选rhKGF1_dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1_dest23蛋白,Western blotting法鉴定rhKGF1_dest23蛋白。结果： pET22b-rhKGF1_dest23质粒与BL21AI 宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导, SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10％,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1_dest23蛋白纯度为95%以上,Western blotting法鉴定为rhKGF1_dest23蛋白。结论：成功构建表达人KGF1_dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1_dest23蛋白。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST的构建及其表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28a-Sj26GST,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET28a中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为36×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的26%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28d-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

重组人碱性成纤维细胞生长因子突变体[Ser~(69,87)]的表达、纯化及其稳定性研究

目的:对野生型人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)进行突变改造以提高其稳定性.方法:采用PCR突变方法,将hbFGF cDNA第69位和87位的Cys密码子突变为Ser密码子,所得的突变片断插入表达载体pET3c的表达框架中,构建了表达菌株BL21(DE3)/pET3c-[Ser69,87]hbFGF,IPTG诱导表达.通过离子交换、肝素亲和两步层析的方法分离纯化突变体蛋白[Ser 69,87]hbFGF.MTT法测定重组蛋白的促分裂活性.并对突变体蛋白的抗蛋白酶水解能力、热稳定性及其酸碱稳定性进行了检测.结果:所构建的表达菌株,其[Ser69,87]hbFGF的表达量占菌体总蛋白的30%以上.经两步层析纯化,获得了纯度达98%的突变体[Ser69,87]hbFGF.纯化的样品促Balb/c 3T3细胞增殖的活性与野生型hbFGF相当.突变体[Ser69,87]hbFGF抗胰蛋白酶水解的能力较野生型hbFGF强;热稳定性和酸碱稳定性也较野生型hbFGF高.结论:突变体[Ser69,87]hbFGF的生物学活性与野生型hbFGF相当,其稳定性明显高于野生型hbFGF.     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a( )原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体。方法采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a( ),通过两次定点诱变得到pET28a( )-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度。结果经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1∶100000。结论成功构建pET28a( )-野生型LPL及pET28a( )-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础。     

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

摘要：目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希
菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗
体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37 000;
Western blot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。
结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的 构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a(+)原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体.方法 采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a(+),通过两次定点诱变得到pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度.结果 经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的 蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1:100 000.结论 成功构建pET28a(+)-野生型LPL及pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础.     

结核分枝杆菌H37Ra株fbpC基因的克隆与表达

目的：探讨克隆结核杆菌H37Ra菌株抗原fbpC基因及在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达。方法：通过聚合酶链反应扩增人结核杆菌弱毒性菌株H37Ra的编码基因ibpC,并定向克隆到原核表达载体pET-28a,通过酶切、聚合酶链反应和测序鉴定重组质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）中,由异丙基硫代半乳糖苷诱导表达,十二烷基磺酸纳一聚丙烯酰胺和Westernblot鉴定表达的重组蛋白。结果：成功构建了pET28a—fbpC重组质粒;在大肠埃希菌中表达了相对分子量约33000的重组蛋白。结论：重组质粒pET28a—fbpC成功构建和表达,为fbpc反应原性、免疫诊断价值的研究提供参考。     

人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达与初步纯化

目的确立人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达条件和初步纯化条件。方法将pET32a（＋）/SLC分别转化大肠杆菌AD494（DE3）、BL21trxB（DE3）、BL21trxB（DE3）plusS．选择最佳宿主菌，优化诱导表达的条件，将大量表达的目的蛋白经金属离子亲和层析、除盐、肠激酶酶切、阳离子交换进行初步纯化。结果pET32a（＋），SLC最佳宿主菌为BI。21trxB（DE3）．优化的表达条件为37C、1mmol／LIPTG诱导3h，SDS-PAGE分析可见，表达蛋白的大小约为30kd，占菌体总蛋白的50%以上．可溶性蛋白约占50％。用SLC多克隆抗体进行Westernblm分析显示，在30kd处出现单一阳性条带，而对照的pET32a（＋）／BL21trxB（DE3）诱导菌则无此反应。SLC经一系列纯化步骤得到初步纯化。结论初步建立pET32a（＋）／SLC在宿主菌BL21trxB（DE3）中表达和纯化的方法。     

人Api6融合蛋白原核表达系统的构建

目的:本研究拟采用蛋白原核表达的方法,诱导表达人Api6(Apoptosis inhibitor 6)融合蛋白,为进一步研究Api6在凋亡抑制、脂质代谢和肿瘤发生中的作用奠定基础.方法:利用PCR技术扩增人Api6基因,将其克隆至原核表达载体ppSUMO,构建重组质粒ppSUMO-Api6;重组质粒转化原核表达宿主菌E...     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用.方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2 分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用.结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力.结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础.     

抗癌蛋白NOR1基因工程重组蛋白表达条件的优化和纯化

目的:构建NOR1基因原核表达载体,并在大肠杆菌中原核表达NOR1重组蛋白,对其诱导条件进行优化,并纯化NOR1蛋白.方法:PCR扩增人NOR1基因全长开放阅读框,克隆入原核表达载体pET28b.重组质粒转化大肠杆菌,采用不同温度、不同抗生素浓度、不同IPTG浓度诱导NOR1蛋白表达.选择最佳条件大量诱导NOR1蛋白表...     

基孔肯雅病毒包膜蛋白E2的全基因合成及原核表达

目的通过对全长基孔肯雅病毒包膜蛋白E2(CHIKV-E2,1～404 aa)及其跨膜疏水区(351～378 aa)缺失突变体E2(1～350 aa)进行原核表达,分析跨膜疏水区对E2蛋白在大肠杆菌中表达的影响。方法利用ExPasy预测软件对E2蛋白跨膜疏水区进行预测分析,根据GenBank数据库中CHIKV-E2氨基酸序列获得其对应的基因序列。结合重叠延伸PCR(OE-PCR)原理设计用于全基因合成的核酸引物对CHIKV-E2全长基因(404 aa)进行体外合成,构建全长E2蛋白及其缺失突变体原核表达质粒,将序列正确的两种重组质粒分别转至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组质粒的表达情况。结果 OE-PCR法成功合成了大小为1 212 bp的编码CHIKV-E2(1～404 aa)蛋白的全长基因,构建了全长E2蛋白及其缺失突变体重组表达质粒pET21b-E2(1～404)和pET21b-E2(1～350),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示缺失突变体pET21b-E2(1～350)融合蛋白表达量较pET21b-E2(1～404)有明显提高。结论 E2蛋白跨膜疏水区(351～378 aa)对该蛋白的原核表达具有重要影响,缺失该疏水区的突变体在大肠杆菌中表达量比全长E2蛋白表达量明显提高。     

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的：从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2（ CDC2）,并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法：从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2 cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和 XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果：RT-PCR扩增出约894 bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论：从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。     

人颗粒溶素的原核表达

目的克隆人颗粒溶素基因并进行原核表达。方法体外培养外周血单个核细胞并抽提总RNA,RT．PCR扩增人颗粒溶素的基因片段,鉴定正确后构建原核表达质粒pET—GNLY9K和pET—GNLYl5K,并将其转入大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS—PAGE和Western—blotting鉴定融合蛋白的正确性。结果成功构建了原核表达载体pET—GNLY9K和pET—GNLY15K,经诱导在原核表达系统中高效表达了相应分子质量分别约为31和37kD的融合蛋白。结论利用原核表达体系成功表达了不同相对分子质量的颗粒溶素融合蛋白。     

Expression and purification of recombinant human hemangiopoietin in Escherichia coli

Objective： To express the soluble recombinant hemangiopoietin protein in E. coli BL21 （DE3）. Methods： Using human fetal live cDNA as a template, a partial cDNA fragment of HAPO coding N-terminal region was subcloned into plasmids pTrc99, pQE60 and pET32c to construct different recombinant prokaryotic expression systems. After selecting, the soluble rhHAPO fusion protein was expressed stably in E. coli BL21 （DE3） by vector pET32c-HAPO and further isolated by nickelnitrilotriacetic acid （NTA） affinity chromatography. After cleavage with enterokinase, the rhHAPO protein was applied to Fast Flow SP sepharose column. Results： The rhHAPO protein had a purity of more than 95% and a good bioactivity based on the cell adhesion assay in ECV304 cells. Conclusion： We have established a protein engineering system to produce rhHAPO which may provide the possibility for clinical application     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。