HCV不同编码区重组基因的蛋白表达丰度分析

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)不同基因片段重组载体在pET大肠杆菌系统中的蛋白表达情况.方法:分别将构建好的含有HCV C、NS3、NS5片段基因的pET重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.通过卡那霉素抗性筛选转化子.经过IPTG诱导表达相应的重组蛋白,通过Ni-NTA凝胶亲和层析纯化各目标蛋白,并分别计算各重组蛋白的浓度.结果:分别诱导表达含有HCVC、NS3、NS5片段基因的重组蛋白,各蛋白的浓度分别为:3.557(1型NS3)、4.238(6型NS3)、2.087(NS5)、1.490g/L(C).结论:在相同条件下,诱导表达含有HCV不同基因片段的重组载体,所得到的蛋白丰度存在差异.     

人细小病毒B19中国株结构蛋白VP1的克隆及表达

目的 :构建人细小病毒B1 9中国株结构蛋白VP1基因片段的重组表达载体 ,探索大量表达VP1蛋白的最佳条件。　方法 :从该科保存的人细小病毒B1 9中国株结构蛋白VP1基因片段的重组克隆载体中获得VP1基因片段 ,将该片段亚克隆入表达载体pQE 30 ,构建VP1 pQE 30原核表达载体 ,并转化至感受态大肠杆菌M1 5中 ,给予不同浓度诱导剂异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)及在不同温度下进行诱导表达。　 结果 :成功构建了融合蛋白VP1 pQE 30的重组表达质粒 ,表达的融合蛋白经 1 5 %SDS PAGE电泳证实其相对分子质量为 2 2 0 0 0。IPTG浓度为 1mmol/L ,诱导表达 5h ,37℃下无表达 ,2 5℃下有表达 ;采用不同的IPTG浓度诱导表达 5h ,0 .0 5mmol/L至 1mmol/L均有表达 ,表达率相近 ,为 (1 6± 1 ) %。　结论 :获得人细小病毒B1 9中国株结构蛋白VP1基因片段的原核表达载体及其产物 ,对进一步研究其纯化及制备单克隆抗体和疫苗有重要意义     

GRα-GST融合表达载体的构建及重组蛋白的表达

[目的]构建GRα-GST融合表达载体并获得重组蛋白,以期为筛选类糖皮质激素样中药提供工具.[方法]运用RT-PCR扩增得到包含CDS的GRα基因序列后,经T-A克隆插入PMD-18载体.以此重组载体为模板扩增含有BamH I与Xho I酶切位点的GRαORF,插入pGEX-4T-1载体后形成了重组载体,并使其在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达融合蛋白,再用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达.[结果]成功的将GRα-全基因构建入原核表达载体pGEX-4T-1中.测序结果表明载体构建成功,无插入和移码突变.经IPTG诱导后获得与预测大小(112kDa)完全一致的目的蛋白即GRα-GST融合蛋白.[结论]成功获得了含重组载体的大肠杆菌,并在IPTG诱导下较好的表达,得到了GRα-GST融合蛋白.     

融合蛋白AnxB1ScuPA表达质粒的构建及诱导条件优化

目的:在大肠杆菌中高效表达融合基因AnxB1ScuPA.方法:利用PCR技术扩增AnxB1ScuPA的融合基因,克隆至原核表达载体pET-28a;转化几种不同的宿主菌(感受态细菌BL21、Rosetta、BL21-RIL),利用IPTG(终浓度为0.5 mmol/L)诱导蛋白表达,并对表达条件进行优化,根据凝胶扫描定量结果确定合适的宿主菌和诱导表达条件.结果:AnxB1ScuPA在具有稀有密码子tRNA的宿主菌BL21-RIL表达量较其他宿主菌为高.在菌液生长至D600＝0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.4 mmol/L,诱导0.5 h后加入利福平至终浓度150 μg/ml,可使蛋白AnxB1ScuPA的表达量提高至菌体总蛋白的36%.结论:通过选择具有稀有密码子tRNA的宿主菌BL21-RIL和优化诱导条件,使AnxB1ScuPA在大肠杆菌中得到高效表达.     

岸蟹金属硫蛋白在大肠杆菌BL21中的表达

目的：在大肠杆菌BL21中表达岸蟹金属硫蛋白基因，建立金属硫蛋白原核表达的流程。方法：将重组质粒pET-GST-R转化至大肠杆菌，经PCR扩增和酶切检测，得到含重组质粒pET-GST-R的工程菌。结果：从IPTG浓度、IPTG诱导时间、金属离子浓度等几个方面摸索诱导金属硫蛋白表达的条件，表达出分子量约为33kD的融合蛋白。结论：成功制备金属硫蛋白的工程菌菌株。金属硫蛋白对大肠杆菌细胞毒性很大，培养基需添加金属离子。     

PTD-Cyclin D1融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:通过PCR方法扩增出Cyclin D1基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD的下游构建重组质粒pET16b-PTD-CCND1,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pET16b-PTD-CCND1,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr 38×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化后得到了目的蛋白.结论:成功地克隆了小鼠的Cyclin D1基因并纯化了融合基因PTD- CCND1的原核表达产物.     

高纯度可溶性嵌合蛋白VEGI+的表达纯化

目的:制备纯化的新型血管生长抑制剂可溶性嵌合蛋白VEGI ,为进一步研究其活性奠定基础.方法:应用PCR方法制备血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI ,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a( )重组,构建重组表达载体pET30a-VEGI ,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,纯化并鉴定表达产物.结果:成功扩增融合基因VEGI ,构建的重组质粒pET30a-VEGI 酶切鉴定结果与预期一致,诱导后表达产物以包涵体为主.SDS-PAGE电泳及Western印迹结果表明,复性纯化后的嵌合蛋白VEGI 相对分子质量约为23 000,纯度约为90%.结论:成功构建了重组表达载体,并在大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的可溶性嵌合蛋白VEGI .     

幽门螺杆菌1pp20基因在大肠杆菌TB1中诱导表达方法的研究

目的 :研究影响幽门螺杆菌lpp2 0基因在大肠杆菌TB1中表达的因素 ,探索高效表达的条件 ,为幽门螺杆菌疫苗抗原的纯化和生产奠定基础。方法 :用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp2 0基因片段 ,将目的基因插入的表达载体pMAL c2X中 ,用重组质粒转化大肠杆菌 (E .coliTB1)。采用不同的诱导时间、IPTG浓度和诱导温度进行诱导表达 ,应用SDS PAGE方法对表达产物进行分析。结果 :在诱导 1～ 4h之间 ,融合蛋白的表达量变化较为显著 ,而 4～ 8h之间则无显著变化 ;IPTG终浓度低于 0 .2mmol/L或高于3 .2mmol/L均能显著减少融合蛋白的表达量 (P <0 .0 5 ) ,而IPTG终浓度在 0 .4～ 2 .4mmol/L之间时 ,对融合蛋白的表达量并无显著影响 ;诱导温度在 3 0℃～ 40℃之间变化对融合蛋白的表达量无显著影响 ,超出此范围可使表达量显著减少 (P <0 .0 5 ) ;在优化诱导条件后 ,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白的 3 4%。结论 :通过调整诱导时间、IPTG浓度和诱导温度 ,lpp2 0基因与载体pMAL c2X的重组质粒在E .coliTB1中能够高效表达。     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :体外表达人源性MT 1E融合蛋白并进行纯化。方法 :采用RT PCR方法获得人MT 1E基因的编码区 ,将其克隆入原核表达载体pQE4 0 ,并在大肠杆菌M15中表达 ,对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析 ,用Ni NTagarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果 :重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在 ,但以不可溶性形式为主 ,表达量随诱导时间延长而增加 ,在诱导 8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的 32 %。经亲和层析获得较高纯度的人MT 1E融合蛋白。结论 :利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT 1E融合蛋白 ,为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的 获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础.方法 以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET2a相匹配的酶切位点,插入载体pET2a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性.结果 该基因在原核表达系统中经诱导,得到了M_r1000的可溶性融合表达产物.经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上.免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B6感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别.结论 弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值.     

Soluble expression and characterization of the immunoreactive multiepitope antigen of Toxoplasma gondii in E.coli]

OBJECTIVE: To obtain soluble expression product of immunoreactive recombinant multiepitope antigen of Toxoplasma gondii from E.coli. METHODS: The gene encoding the multiple epitopes (MEG) of Toxoplasma gondii was amplified by PCR from the original plasmid containing MEG gene and cloned into the prokaryotic soluble expression vector pET32a. After identification by enzyme digestion and sequencing, the positive recombinant plasmid pET32a-MEG was transformed into BL21(DE3), which was induced with IPTG for expression of the target antigen. The relative molecular mass, solubility and antigenicity of the expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. RESULTS: The recombinant expression plasmid pET32a-MEG was successfully constructed and the highly efficient expression of the antigen was achieved after IPTG induction of E.coli. Improvement of the induction condition increased the expression product which accounted for about 28% of the total bacterial protein. The target protein, with good solubility and a relative molecular mass of about 31 000, was purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and could be well recognized by mouse and rabbit antisera derived by infection of the animals with Toxoplasma gondii B36 and RH, respectively. CONCLUSION: The recombinant multiepitope antigen has good antigenicity and potential value in diagnosis and vaccine development of toxoplasmosis.     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

人成熟转化生长因子β1蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人成熟转化生长因子β1（hmTGF-β1）的原核表达载体,表达并纯化hmTGF-β1蛋白。方法应用RT-PCR方法获得hmTGF-β1基因,连接至自带6His标签表达载体pET23b,构建原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,诱导表达hmTGF-β1融合蛋白,镍亲合层析法纯化融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析。结果成功构建了hmTGF-β1原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析,在约15kD处出现了一条新的蛋白条带,WesternBlot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合。应用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,分析纯度达95%。结论成功构建了hmTGF-β1蛋白的原核表达质粒,并成功表达与纯化hmTGF-β1蛋白,为进一步复性、获得有活性的hmTGF-β1打下基础。     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果 成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论 成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.     

土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE的克隆与表达

目的 克隆表达土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE,为研究lovE蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体pET21b(+)构建lovE原核表达质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白.结果 构建了pET-lovE原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得6×His-lovE融合蛋白,蛋白纯度...     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）的原核表达及分离纯化

目的 建立肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）原核表达系统.方法用生物信息学软件OptimumTM Codon优化密码子适应指数（CAI）、最优密码子频率（FOP）及GC含量以获得适合大肠杆菌BL-21表达的FhSAP-2基因序列,并克隆到原核表达载体pET22b和pET28a中,经IPTG诱导其表达并经亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的 蛋白.结果 OptimumTM Codon获得优化后的FhSAP-2序列,经测序及酶切鉴定结果表明重组质粒pET22b-FhSAP-2、pET28a-FhSAP-2构建成功,进一步实验结果表明FhSAP-2在pET28a中包涵体部位表达,可溶部位不表达;在pET22b中可溶部位表达量低,包涵体部位无表达.继而经Ni-NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得电泳纯的FhSAP-2蛋白.结论成功建立FhSAP-2的原核表达系统.