外源性P16基因导入对人膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：将外源性P16基因导入该基因纯合性缺失的人膀胱癌细胞系，观察对肿瘤细胞增殖活性及凋亡的影响。方法：构建P16逆转录病毒表达载体，转染膀胱癌细胞系，应用Northern杂交及免疫细胞化学检测外源性P16基因的表达；流式细胞仪检测细胞周期，原位细胞凋亡检测及透射电镜观察细胞凋亡。结果：转染外源P16基因的肿瘤生长速率明显降低，Ki67标记指数下降，大多数细胞被抑制在G0和G1期，同时发现凋亡细胞的存在。结论：外源性P16基因导入不仅抑制膀胱癌细胞的增殖，且可诱导其凋亡。     

反义寡核苷酸减弱转染p16基因对包装细胞生长的抑制

目的:应用p16(MTS1)反义寡核苷酸抑制转染p16逆转录病毒载体后外源性p16基因的表达,减弱p16表达对包装细胞的生长抑制作用.方法:合成p16 cDNA起始密码子区的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸,加入筛选的转染p16逆转录病毒载体的包装细胞培养液中,记录各孔中出现细胞克隆的时间和数量,测量各形成细胞克隆的病毒上清滴度.Western blot 检测反义寡核苷酸对外源性P16蛋白表达的影响.MTT法检测加入反义寡核苷酸后对转染的包装细胞生长的影响.结果:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达.加入反义寡核苷酸的包装细胞形成细胞克隆的时间提前,克隆数量和滴度都高于对照组.结论:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达,促进p16逆转录病毒载体转染的包装细胞的生长并提高病毒滴度.     

腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用

目的 研究p16基因对胆管癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体朱病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导,用RT-PCR方法检测,在胆管癌QTBC939细胞系中p16呈低表达,重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,重组体朱病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数和细胞DNALadder,证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。     

人肺腺癌细胞系GLC-82中p21WAF1和p53基因的过表达

目的 探讨p21^WAF1和p53基因过表达对人肺腺癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法 用带有p21cDNA的真核表达载体pCEP和带有p53的腺病毒表达载体pAdCMV,分别通过基因转染和腺病毒感染,使其在人肺腺癌细胞系(GLC—82)中过表达;通过流式细胞仪、透射电镜和原位末端分析(TUNEL)观察细胞的生长和凋亡情况。结果 p21过表达的细胞系G1期细胞增加,细胞生长抑制,克隆形成率下降,电镜下未见特征性凋亡小体,原位细胞凋亡分析未见凋亡信号;p53腺病毒感染的肿瘤细胞增殖明显抑制并出现死亡,原值细胞凋亡检测到凋亡信号。结论 P21和p53基因的过表达能够抑制人肺腺癌细胞的生长,其中p53能够诱发细胞凋亡,因此这两种基因在肿瘤基因治疗上有着广泛的应用前景。     

外源性p16基因与放疗联合治疗喉鳞癌的实验研究

目的　探讨外源性 p16基因对人喉鳞状细胞癌的抑制作用及与放射治疗联合应用的协同增敏作用。方法　应用携带 p16基因的复制缺陷型腺病毒 (Ad- p16 )转染人喉鳞癌细胞株 ,用 Western Blot方法检测 p16基因在喉鳞癌细胞中的表达 ,体外、体内实验观察 p16基因治疗和放射治疗对喉癌细胞的生长抑制作用。结果　复制缺陷型腺病毒载体可有效地将外源性 p16基因转染入人喉鳞癌细胞株中并使其表达 P16蛋白 ;体外、体内抑瘤实验表明 :Ad- p16基因治疗组、单纯放疗组和 Ad- p16基因与放疗联合治疗组肿瘤生长均明显受抑制 ,疗效显著优于携带 L ac Z基因的重组腺病毒 (Ad- L ac Z)组和 PBS对照组 (P<0 .0 5 ) ,其中联合治疗组肿瘤生长最为缓慢 ,与 Ad- p16基因治疗组和单纯放疗组比较均有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论　 p16基因可有效地抑制人喉鳞癌细胞生长 ,与放射治疗联合应用具有相加和协同效应     

外源性p16基因转染对人膀胱癌细胞PCNA和P53蛋白表达影响的研究

目的：探讨复制缺陷型腺病毒介导的p16基因转染，对人膀胱癌细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)和P53蛋白表达的影响。方法：将p16基因重组腺病毒(Ad—p16)感染P16蛋白表达缺失的人膀胱癌124细胞株，流式细胞术评估Ad-p16对T24细胞中PCNA和P53蛋白表达的影响。结果：PCNA主要在S期和G2-M期高表达，Ad—p16转染T24细胞后，PCNA阳性细胞百分率降低，PCNA表达的荧光强度减弱；Ad—p16转染未能使T24细胞表达P53蛋白。结论：PCNA在Ad—p16转染后其含量减少，PCNA的表达与细胞的增殖能力密切相关，PCNA可作为评估肿瘤细胞恶性增殖能力的指标；Ad—p16转染不能使T24细胞表达P53蛋白。     

转染p16基因对人膀胱癌细胞周期的影响

目的 探讨p16基因对人膀胱癌细胞周期的影响。方法 通过脂质介导的基因转移技术将野生型P16基因导入人膀胱癌细胞系T24中,绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果 与对照组相比,转染p16基因的膀胱癌细胞生长速率降低,流式细胞仪检测显示S期及增殖指数明显降低。结论 p16基因能阻止肿瘤细胞进入S期,抑制肿瘤细胞DNA的合成,对膀胱癌细胞生长起明显抑制作用。     

p16β基因重组腺病毒质粒的构建及对喉癌细胞的作用

目的探讨野生型p16β对体外喉癌Hep-2细胞周期信号传导的干预作用。方法以重组腺病毒为载体，构建p16β的重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β质粒，并在293细胞中包装、纯化。将已纯化的重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β在体外转染Hep-2喉癌细胞，采用MTT实验、流式细胞术（FCM）、免疫组化、Western blot等实验手段检测Hep-2细胞的抑制／杀伤作用及其细胞周期信号、DNA含量、细胞凋亡率的变化；检测P16蛋白的表达和Hep-2细胞的超微结构变化。结果本研究成功地构建和制备了高滴度的AdEasy-GFP-p16β重组腺病毒，并高效地转移到Hep-2细胞内和表达P16蛋白，有效地抑制了Hep-2细胞的生长。被转染的Hep-2细胞被有效地阻滞在G0／G1期，提高了转染细胞的凋亡率。结论重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β能高效感染Hep-2细胞，表达P16蛋白；有效抑制Hep-2细胞增殖；干预Hep-2细胞周期的信号传导机制和细胞周期，诱导凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖活性。     

外源性Rb基因导入对U937细胞周期和p21基因表达的影响

目的 利用RLb基因重组腺病毒载体(AdCMV-RLb)，将外源性RLb基因导入U937细胞，研究其对细胞周期、细胞凋亡及原癌基因p21表达的影响。方法 AdCMV-Rb导入U937细胞后，用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率及Rb蛋白和p21蛋白的表达；RT-PCR检测原癌基因p21的表达。结果 AdCMV-Rb可以高效导入U937细胞，RLb基因导入使U937细胞主要阻滞在G1期，细胞凋亡率在RLb基因导入24h后无明显改变，48h后凋亡率增高；Rb蛋白和p21蛋白表达增强；RT-PCR结果显示Rb基因的导入可以上调p21基因的表达。结论 外源性Rb基因的导入可以上调原癌基因p21的表达，使得U937细胞周期阻滞在G1期。     

外源性p53基因对人胃癌细胞的放射增敏作用

目的:评价外源性p53基因对人胃癌细胞放射敏感性的影响.方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将人野生型p53基因导入不同p53状态的4种人胃癌细胞系,用免疫组化法及Western blot法检测p53基因在胃癌细胞中的表达;用细胞存活份数来表示细胞的生长抑制情况;用流式细胞计数、细胞DNA片段化分析和TUNEL检测细胞凋亡.结果:[ HTSS 在高效靶比病毒剂量下,外源p53基因在4种胃癌细胞的胞核中均高效表达,并可使细胞产生明显的G2/M 阻滞和凋亡,使细胞存活份数明显减少.而且这种作用不依赖细胞内在的p53基因状态.单独照射4 Gy,对野生型p53细胞的生长抑制和致凋亡效应明显,而对其它3种细胞的作用较弱 .照射4 Gy结合Ad-p53时,外源p53基因可显著增强照射引起的G2/M期阻滞和凋亡及生长抑制作用,对4种胃癌细胞放射增效比高达2.3～3.6.结论:腺病毒载体介导的野生型p53基因转染4种胃癌细胞后有明显的放射增敏作用.     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

Cloning of Chicken Anemia Virus vp3 Gene and Apoptosis Inductive Effect of vp3 Gene In Vitro

Chickenanemiavirus (CAV)isaparticulartypeviruswithadiameterofabout 2 3nmandcontainsacircularsinglestrandDNA (minusstrand)of 2 .3kb .ItwasfirstisolatedbyYuasaetalin 1979[1] ,andbelongstotherecentlyestablishedvirusfamilyofCircovirdae[2 ] .ExperimentsperformedbyNotebornetaldemonstratedthatCAVinducesdepletionofcellsviaapoptosisandthecellularbackgroundspeci fiesthesusceptibilitytoCAV[3] .Theinvitroexper imentsdemonstratedthatVP3isthefunctionalpro teinofCAV .AndtheCAVVP3proteincanonlyin du…     

鸡贫血病毒VP 3基因的克隆及其体外凋亡诱导效应的研究

用PCR方法扩增了鸡贫血病毒标准株的vp3基因,并将其克隆于真核表达载体pcDNA3上,构建了重组体pcDNA-vp3.经酶切鉴定及测序分析表明,该片段和预期相符.在体外利用LipofectAMINETM介导的基因转染,将pc-DNA-vp3、pcDNA3分别转入肝癌细胞系HepG2和二倍体肝细胞系L-02中,转染后的RT-PCR结果证实vp3基因在细胞中得到了表达.同时利用筛选稳定表达细胞株的技术和原位细胞凋亡检测法,证明了鸡贫血病毒是以凋亡的方式诱导细胞死亡,并且只诱导癌细胞的凋亡,而不诱导正常或二倍体细胞死亡.表明鸡贫血病毒vp3基因很可能成为一种极具潜力的抗肿瘤生物制剂.     

靶向肝癌表达p16基因的腺病毒载体对裸鼠移植瘤的抗癌活性

目的:利用已构建好的在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体AdAFP-p16,研究腺病毒介导p16基因的表达对肝癌裸鼠移植瘤的抗癌活性.方法:培养肝癌细胞SMMC-7721,于裸鼠右侧腹部近腋下皮肤注射1×106细胞数细胞悬液,建立裸鼠肝癌移植瘤模型.成瘤后给于瘤体内AdAFP-p16病毒注射治疗,病毒总量1×109 pfu/只,观察AdAFP-p16对肝癌模型的抗肿瘤疗效以及p16基因表达引起的肝癌细胞病理变化.结果:AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,具有明显的肿瘤生长抑制作用,抑制率可达60.12%(P＜0.01),引起肝癌细胞的坏死.结论:AFP启动子控制的p16基因在肝癌细胞中定向表达,能够抑制肝癌模型的生长,对肝癌综合治疗具有重要意义.     

p16、p53和c-erbB-2蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的:探讨p16、c-erbB-2 和 p53蛋白表达与膀胱移行细胞癌(TCC)病理分级、临床分期和转移的关系.方法:应用免疫组化SP法对75例膀胱癌组织中p16、p53及c-erbB-2蛋白表达进行检测.结果:75例膀胱癌中p16、p53及 c-erbB-2 的阳性率分别41.3%(31/75)、44.0%(33/75)和40.0%(30/75),p16和 c-erbB-2 蛋白在膀胱癌中的阳性率与肿瘤病理分级和临床分期有显著意义(P<0.05),p53和 c-erbB-2 阳性率与肿瘤临床分期及转移有密切的关系(P<0.01).77.3%(58/75)肿瘤有上述蛋白的阳性表达,其中53.3%(40/75)的肿瘤同时有多个蛋白的阳性表达.结论:肿瘤的多因素分析比单因素分析更有价值,癌基 c-erbB-2 和抑癌基因p53、p16蛋白的表达异常及协同作用在膀胱癌的发生发展中起重要作用.     

靶向沉默Notch1基因对膀胱癌细胞系T24增殖的影响

目的探讨Notch1基因沉默对人膀胱癌细胞增殖的影响。方法用pGenesil质粒构建靶向Notch1的siRNA真核表达载体psiRNA1,并将其转染到膀胱癌细胞系T24中,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)、流式细胞术(FCM)检测Notch1沉默后膀胱癌细胞生长变化、细胞周期和凋亡情况。逆转录聚合酶链反应（RT PCR）和蛋白印记法（Western Blot）检测Notch1基因的mRNA和蛋白在转染前后表达变化。结果转染psiRNA1质粒后T24细胞的生长受到显著抑制,呈一定的时间依赖性（60?h内）,凋亡率增加,G0/G1期细胞明显增多（未转染组、空载体组、阴性对照组）,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,且Notch1基因在mRNA和蛋白水平表达相对于对照组明显下调（P＜0.05）。结论沉默Notch1基因能够抑制膀胱癌细胞的增殖,Notch1在膀胱癌中可能具有癌基因的作用。