RNA干扰抑制人食管鳞癌细胞PLK1基因的表达

目的 利用RNA干扰（RNAi）技术,研究Polo样激酶l（PLK1）基因特异的siRNA对人食管鳞癌细胞Eca-109 PLKl基因表达的影响.方法将PLKI基因特异性siRNA转染入人食管鳞癌细胞Eta-109,采用RT、-PCR和Western-blot技术检测siRNA处理前后Eca-109细胞PLK1基因表达变化,并构建PI.K1基因特异性siRNA质粒表达载体.结果转染R后T-PCR和Western-blot结果均显示Eca-109细胞PLK1基因的表达明显下降,PLKI基因特异性siRNA质粒表达载体构建成功.结论 PLKl特异性siRNA对Eca-109细胞PLK1基因的表达有抑制作用.     

RNA干扰survivin基因对人食管癌EC109细胞体外增殖和化疗敏感性的影响

目的研究RNA干扰survivin基因对EC109细胞体外增殖和化疗药物敏感性的影响。方法构建siRNA-survivin真核表达载体，转染EC109细胞，筛选得到稳定细胞克隆。同时设空载体和构建非特异siRNA载体转染为对照；MTT法检测各组细胞的体外增殖速度和比较它们对化疗药物顺铂的敏感性；流式细胞仪检测各组细胞的周期变化。结果siRNA-survivin转染的EC109细胞体外增殖受到抑制；不同浓度顺铂对各组细胞的增殖有抑制作用，且呈剂量依赖性。siRNA-survivin转染的EC109细胞的IC50为1．0188μg／mL，低于其他组（P〈0．05）；siRNA-survivin转染的EC109细胞组细胞周期明显阻滞于G0／G1期（P〈0．05），S期比例也低于其他组（P〈0．05）。结论RNA干扰survivin基因具有抑制人食管癌EC109细胞体外增殖和提高细胞对化疗药物顺铂敏感性的作用．将更多细胞阻滞在G0／G1期是其重要的作用机制。     

NuclesteminsiRNA对人肺腺癌紫杉醇耐药株A549／Taxol的耐药性逆转的研究

目的：探讨Nuclestemin基因（NS）特异性RNA干扰对人肺腺癌紫杉醇耐药株A549／Taxol细胞耐药性的逆转作用。方法：NS特异性RNAi表达载体转染A549／Taxol细胞。提取肿瘤细胞总RNA,用RT—PCR方法检测NS的表达;利用M1Tr法检测紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）。结果：NS特异性RNAi表达载体转染A549／Taxol细胞后,Ns的表达量明显降低,并且对紫杉醇敏感性的相对逆转率达65．3％。结论：．Nuclestemin基因siRNA能有效逆转A549／Taxol细胞的耐药性,明显提高耐药细胞对紫杉醇的敏感性。     

RNA干扰Livin联合顺铂对食管癌细胞Eca-109增殖和凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰Livin联合顺铂对食管癌细胞Eca-109增殖和凋亡的影响及相关作用机制.方法 利用慢病毒载体构建shRNA-Livin系统并转染至食管癌细胞Eca-109,将Eca-109细胞分为5组:正常对照组、阴性对照组、干扰组、顺铂组、联合组(干扰+顺铂).采用分光光度法、二甲氧唑黄比色法(XTT)、流式细胞术(FCM)、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)、透射电镜(TEM) 分别检测食管癌细胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Caspase-9表达,细胞增殖、细胞周期、凋亡及形态学改变情况.结果 转染后,Eca-109 细胞Caspase-3、Caspase-9表达明显增强(P<0.01),细胞存活率明显降低(P<0.01);经RNA干扰后,细胞周期主要被阻滞于S期,细胞凋亡率明显增加;TEM下可见典型的凋亡细胞.与顺铂组比较,联合组细胞的上述表现尤为明显.结论 Livin靶向RNA干扰联合顺铂通过上调Caspase-3、Caspase-9的表达从而抑制 Eca-109 细胞的增殖和促进其凋亡.     

Nucleostemin 特异性RNA干扰对肿瘤细胞增殖能力的影响

目的：检测肿瘤细胞Nucleostemin(NS)的表达，研究NS特异性RNA干扰对Hela细胞体内外增殖的影响。方法：提取6种肿瘤细胞总RNA，用RT-PCR和Northern blot方法检测NS的表达。用NS特异性siRNA表达载体转染Hela细胞，观察转染的Hela细胞(简称NS-SiRNA-Hela细胞)体内外增殖的变化。结果：6种肿瘤细胞中NS显高表达。体外培养的NS-siRNA-Hela细胞中NS表达显降低，Gn／G，期细胞百分率显升高。体内致瘤实验显示，NS-siRNA-Hela细胞在裸鼠体内增殖显降低。结论：NS在肿瘤细胞中高表达具有普遍性。NS特异性RNA干扰使Hela细胞进入S期受阻，并可明显降低Hela细胞体内外的增殖能力。     

RNA干扰survivin基因对Eca-109细胞体内增殖的影响

目的利用RNA干扰抑制Eca-109细胞survivin基因表达,观察survivin沉默后对食管癌细胞Eca-109体内增殖的影响。方法构建靶向survivin基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染Eca-109细胞,建立稳定转染干扰组细胞Eca-109/si-survivin;同法建立阴性对照组细胞Eca-109/si-control,并以Eca-109为空白对照组细胞;通过Western blot检测survivin基因沉默效果;借助裸鼠移植瘤模型分析survivin干扰前后裸鼠成瘤时间及瘤结节质量的改变,比较各组Eca-109细胞的体内增殖速度;通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术法检测移植瘤细胞凋亡的变化。结果干扰组细胞survivin蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组细胞survivin蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠平均瘤结节质量显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠的平均瘤结节质量差异均无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的体内增殖。     

17-AAG联合紫杉醇对Eca-109食管癌细胞增殖的抑制作用

目的研究17-AAG联合紫杉醇（PTX）对食管癌细胞Eca-109增殖和凋亡的影响。方法予以PTX和17-AAG单独或联合
使用作用于Eca-109细胞株,采用MTT法检测其细胞增殖的变化,应用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡的变化。结果与对照组
相比,单独使用17-AAG、PTX均能够抑制Eca-109细胞的增殖;0.5 μmol/L PTX联合0.625 μmol/L 17-AAG可抑制Eca-109的生
长,且联合效应明显强于各自单药组（P<0.01）;流式细胞仪检测结果显示：17-AAG将Eca-109 细胞阻滞于G2/M 期,PTX将
Eca-109 细胞阻滞于S 期。17-AAG与PTX 联合用药使Eca-109 细胞阻滞于G2/M 期和S。17-AAG组、PTX组及联合组作用
Eca-109细胞株24 h后其凋亡率分别为4.52%、10.91%、29.88%,显著高于对照组（1.32%）;联合用药后,可形成明显凋亡峰,明显高
于单药组。结论PTX和17-AAG均可抑制食管癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,两者联合可增强上述作用。
     

MCF-7细胞中组织型纤溶酶原激活剂乳腺特异性表达载体的瞬时表达

目的：验证所构建的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺特异性表达载体pWTA在乳癌细胞系MCF-7中的瞬时表达。方法：用脂质转染胺试剂Lipofectamine^TM2000将pWTA DNA转染人乳癌细胞系MCF-7和食管癌细胞系Eca-109。应用原位杂交技术,以地高辛标记的tPA cDNA为探针,观察PWTA的瞬时表达。结果：不同浓度Lipofectamine^TM2000 MCF-7细胞原位杂交均为阳性;Eca-109细胞及未加转染液者未见阳性信号。结论：载体pWTA为tPA乳腺特异性表达载体。     

存活蛋白反义寡核苷酸诱导食管癌细胞凋亡的研究

目的观察存活蛋白反义寡核苷酸转染对食管癌细胞凋亡、增殖、对化疗药物敏感性的影响。方法设计合成特异性存活蛋白反义寡核苷酸（ASODN）。食管癌EC109细胞系分为6组：空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、160、200、240nmol／L ASODN转染组。作用20h后收获各组细胞,Western blot法检测各组细胞生存素表达情况。TUNEL法检测各组细胞的凋亡情况。结果各ASODN转染组细胞存活蛋白表达有不同程度减弱,细胞变圆、折光增强、细胞碎片形成等,而各对照组细胞生长良好。各ASDON转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组（P〈0．05）,以240nmol／L转染组最明显（P〈0．05）。结论封闭食管癌细胞存活蛋白基因,能下调存活蛋白的表达,从而诱导食管癌细胞凋亡,抑制食管癌的发展。     

SIRT1通过调控Snail表达参与食管癌EC-9706和Eca-109细胞的上皮间质转化

目的探讨沉默信息调节因子1（SIRT1）诱导食管癌EC-9706和Eca-109细胞上皮间质转化（EMT）发生中的作用和机制。 方法转染3条化学合成SIRT1 siRNA入食管癌EC-9706和Eca-109细胞,以空白细胞和转染阴性对照siRNA细胞作为对照, real-time PCR和western blot 检测转染效果。Transwell 侵袭小室和划痕实验检测各组细胞的侵袭转移能力变化。Real-time PCR和Western blot检测各组细胞上皮间质转化相关分子E-cadherin和vimentin的表达变化,同时进一步检测E-cadherin转录 抑制因子Snail、twist1 和ZEB的表达变化。结果与空白组和阴性对照组细胞相比,转染SIRT1 siRNA1 和SIRT1 siRNA3 的 EC-9706和Eca-109细胞SIRT1 mRNA和蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）。Transwell侵袭小室和划痕实验 结果显示转染SIRT1 siRNA1和SIRT1 siRNA3组EC-9706和Eca-109细胞穿膜细胞数和划痕愈合能力较空白组和阴性对照组 细胞下降,差异有统计学意义（P<0.05）。转染SIRT1 siRNA1和SIRT1 siRNA3组EC-9706和Eca-109细胞E-cadherin表达明显 升高,而vimentin 表达下降,与空白组和阴性对照组细胞相比差异有统计学意义（P<0.05）。转染SIRT1 siRNA1 和SIRT1 siRNA3组EC-9706细胞Snail表达下降,与空白组和阴性对照组细胞相比差异有统计学意义（P<0.01）。转染SIRT1 siRNA1和 SIRT1 siRNA3 组Eca-109 细胞Snail 和twist1 表达下降,与空白组和阴性对照组细胞相比差异有统计学意义（P<0.01）。结论 SIRT1有可能通过调控Snail表达诱导EMT发生从而在食管癌细胞侵袭转移中发挥作用。     

食管癌Eca109细胞中Nucleostemin基因表达的实验研究

目的：研究Nucleostemin（NS）基因在食管癌Eca109细胞中的表达及凋亡作用。方法：提取各组食管癌细胞总RNA,用半定量RT-PCR方法检测NS基因的表达情况;用CCK-8法检测3组细胞增殖抑制率;TUNEL试剂盒法检测细胞凋亡情况。结果：与对照组比较,实验组细胞NS基因表达量下降,细胞增殖抑制率〉65%,细胞凋亡增加（凋亡指数为39.47%）差别具有统计学意义。结论：NS基因特异性RNA干扰使食管癌Eca109细胞中NS基因表达量下降,出现细胞增殖抑制,细胞凋亡增加。     

褪黑素联合顺铂对人食管癌Eca109细胞株的增殖抑制作用研究

目的：观察褪黑素（Mel）联合顺铂（DDP）对人食管癌Eca109细胞增殖和凋亡的影响.方法：以DDP 2.5 mg/L、不同浓度Mel及两药联合作用于食管癌Eca109细胞.通过MTT实验检测用药后对食管癌Eca109细胞增殖的影响,并计算抑制率;通过集落克隆形成实验观察用药后对细胞集落克隆形成的影响;通过流式细胞仪检测用药后细胞凋亡率的变化.结果：DDP 2.5 mg/L与不同浓度Mel联合用药组对食管癌Eca109细胞生长抑制率均明显高于单独使用DDP或Mel组（P＜0.01）;10-5 mol/L Mel诱导人食管癌Eca109细胞的24 h凋亡率为7.8%,10-5 mol/L Mel与2.5 mg/L DDP联合刺激人食管癌Eca109细胞的24 h凋亡率为32.0%,高于DDP本身诱导的24 h凋亡率9.7%（P＜0.01）.结论：Mel可增强DDP对人食管癌Eca109细胞增殖的抑制作用,并增强其诱导凋亡作用,为临床食管癌的治疗提供了一定的实验研究基础.     

2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖对人食管癌细胞的抗增殖研究

目的探讨2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(COPADG)对人食管癌细胞Eca-109和TE-1的增殖及其细胞周期的影响.方法采用体外细胞培养,通过MTT比色分析法观察不同浓度COPADG对Eca-109及TE-1细胞生长的抑制作用;流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响;透射电镜下观察细胞的形态学变化.结果COPADG能有效的抑制人食管癌细胞Eca-109及TE-1的增殖,且存在时间及剂量依赖性(P＜0.01);不同浓度的COPADG作用48 h之后,流式细胞仪检测均显示G0/G1期细胞比例增加(P＜0.01),而S期细胞比例减少(P＜0.01),在Eca-109细胞中出现了典型的凋亡峰;电镜下可观察到凋亡的典型形态学变化.结论COPADG能有效抑制人食管癌细胞Eca-109及TE-1的增殖,改变其细胞周期分布,导致明显的G0/G1期阻滞,并在一定浓度下诱导肿瘤细胞凋亡.     

S1P5对食管癌细胞Eca109黏附能力的影响

目的研究S1P5对食管鳞癌Eca109细胞黏附能力的影响。方法从人正常食管黏膜上皮克隆S1P5基因,构建表达载体S1P5-EGFP,转染Eca109细胞,经G418筛选,获得S1P5-EGFP/Eca109稳定细胞株。以对照载体Control-EGFP转染的Eca109细胞作为对照,荧光显微镜下观察细胞的形态,用黏附试验评价其黏附能力。结果成功构建S1P5-EGFP和Control-EGFP载体并转染Eca109细胞获得稳定细胞株。S1P5表达于细胞膜并使细胞略呈梭形改变。S1P5过表达致Eca109细胞黏附能力明显低于对照（P〈0.05）,并且不受其配体1-磷酸鞘氨醇（S1P）的影响。结论 S1P5组成性抑制Eca109细胞的黏附能力,食管癌细胞可能通过下调S1P5的表达增强其黏附。     

肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用的研究

目的研究肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用。方法用脂质体法将人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子调控的肿瘤特异性表达载体hTERT-Caspase-8,瞬时转染端粒酶阳性的食管癌细胞株Eca109及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5。结果转染hTERT-Caspase-8对细胞Eca109的生长具有显著抑制作用,细胞凋亡水平显著升高;转染hTERT-Caspase-8对MRC-5的生长和凋亡均无明显影响。结论上述发现提示hTERT启动子可以调控Caspase-8基因在食管癌细胞中靶向性表达,选择性抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件。     

RNA干扰HO-1的表达增强食管鳞癌Eca109细胞对氟尿嘧啶化疗的敏感度

目的 探讨小干扰RNA沉默HO-1基因表达后食管鳞癌Eca109细胞对氟尿嘧啶化疗敏感度的影响.方法 利用HO-1小干扰RNA（siRNA）及氯化高铁血红素分别沉默和诱导食管鳞癌Eca109细胞HO-1基因的表达,RT-PCR检测HO-1 mRNA水平,Western blot法检测HO-1蛋白表达水平,分别应用MTS法、流式细胞仪检测干预后Eca109细胞对氟尿嘧啶敏感度的变化.结果 RT-PCR、Western blot法检测结果显示,HO-1 siRNA能够有效抑制食管鳞癌Eca109细胞HO-1的表达.HO-1基因干扰后,氟尿嘧啶对Eca109细胞增殖抑制作用增强、凋亡细胞比例增加.结论 干扰HO-1的表达可以显著增强食管鳞癌Eca109细胞对氟尿嘧啶化疗的敏感度.     

MiR-203抑制食管鳞癌Eca109细胞的增殖及侵袭

目的探讨microRNA分子miR-203对食管鳞癌Eca109细胞增殖及侵袭能力的影响。方法根据人源miR-203序列,设计并合成其双链模拟物。通过脂质体转染将miR-203模拟物分子导入食管鳞癌Eca109细胞中,转染无关microRNA模拟物作为对照。测定2组细胞的细胞倍增时间、细胞凋亡率以及侵袭细胞率,观察miR-203对Eca109细胞增殖及侵袭能力的影响。结果Eca109细胞转染miR-203后其细胞倍增时间为(26.1±0.5) h,较对照组(24.2±0.6) h明显延长(P<0.01);其凋亡细胞比例较对照组增加\[(4.5±0.4)% vs (3.7±0.4)%,P<0.05\];Transwell小室侵袭实验显示转染miR-203模拟物后,该组的侵袭细胞率明显低于对照组\[(39.2±5.8)% vs (49.5±6.8)%,P<0.05\]。结论miR-203能抑制Eca109细胞的增殖和侵袭能力,提示miR-203可能是食管鳞癌生物治疗的潜在靶点。     

HER4基因抑制对食管癌细胞Eca-109迁移和侵袭能力的影响

 目的 探讨HER4在食管癌细胞侵袭和转移过程中的作用。方法 应用RNA干扰技术抑制HER4在食管癌细胞系Eca-109中的表达，Western blot 方法观察细胞MMP-9、VEGF蛋白表达水平的变化，细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察细胞迁移、侵袭能力的变化。结果 酶切鉴定和DNA测序分析显示HER4靶向RNA干扰重组载体构建成功；荧光实时定量PCR和Western Blot检测筛选得到最佳干扰效果质粒；该质粒转染细胞后，MMP-9、VEGF蛋白表达水平出现明显降低，细胞迁移、侵袭能力显著下降。结论 HER4与食管癌的侵袭转移潜能相关，敲减HER4的表达可明显抑制食管癌细胞系Eca-109的运动和侵袭能力。     

香加皮宝藿苷-I对人食管癌细胞Eca-109侵袭力的影响

目的探索宝藿苷-I对人食管癌细胞Eca-109侵袭力及TFPI-2基因表达的影响。方法以12.5、25、50μg/ml浓度的宝藿苷-I处理Eca-109细胞48h,分别采用Transwell小室法检测细胞的侵袭能力、RT-PCR法检测细胞TFPI-2mRNA表达水平以及Westernblot法检测TFPI-2蛋白表达水平等。结果 12.5、25、50μg/ml宝藿苷-I均可抑制人食管癌细胞Eca-109的侵袭力并能上调TFPI-2mRNA及蛋白的表达,25、50μg/ml组与对照组相比均有显著差异（P〈0.05）。结论宝藿苷-I能抑制人食管癌细胞Eca-109的侵袭力,可能与上调TFPI-2基因的表达有关。     

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

  目的  探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸（ASODN）对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。  方法  采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸（N-ODN）链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组（5、10、15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞）、对照组（细胞常规培养,不进行细胞转染）、SODN组（细胞转染15 μmol/L的SODN）和N-ODN组（细胞转染15 μmol/L的N-ODN）。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。  结果  与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低（P<0.05）。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、N-ODN组比较差异有统计学意义（P<0.05）。15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高（P<0.05）。  结论  HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路可能有关。