用分子生物学技术分析国内六株旋毛虫分离株

本文首次对来自我国不同地区、不同宿主来源有代表性的6个旋毛虫分离株从基因组DNA的限制性酸切长度多态性、同工酶及可溶性蛋白进行综合研究。核酸结果显示：长春株与其余各地域株的限制性酶切困话间存在着差异，用长春株特异性DNA片段（1．12kb）制成探针，与各株DNA进行Southern杂交，发现各虫株的杂交带型不一，且仅长春株出现1．12kb杂交带。同工酶结果显示：长春株与其余各珠在5种同工酶（GPI、G6PD、HK、6PGDH及AK）酶谱中有显著不同。等电聚焦电泳结果显示：长春株具有一条约4.1PI的特异带。上述结果提示：我国6株旋毛虫分离株间存在着差异，长春株与其余各株差异显著，从而推断我国旅毛虫虫株至少存在2种不同的生物学类型，其间的差异主要与不同的地理分布和／或不同宿主来源有关。     

对我国五株旋毛虫基因组DNA限制性片段长度多态性的研究

本文用５种限制性内切酶（包括ＥｃｏＲＩ及Ｄｒａｌ）消化５株来自长春（分自犬）、天津、西安、河南及云南（分自猪）的旋毛虫基因组ＤＮＡ，结果显示：长春株与其它各地域株的酶切图谱间存在着差异。曾选其中经ＥｃｏＲＩ酶切的特异性ＤＮＡ片段（１．１２ｋｂ），经克隆制备成探针，与经ＥｃｏＲＩ酶切的上述５株虫体ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交。结果显示，仅长春株出现１．１２ｋｂ杂交带，其它４株均未出现该杂交带，提示     

Nucleostemin特异性RNA干扰对HeLa细胞体内外增殖能力的影响

目的：检测肿瘤细胞Nucleostemin（NS）的表达，研究NS特异性RNA干扰对HeLa细胞体内外增殖的影响。方法：提取6种肿瘤细胞总RNA，用 RT-PCR和Northern blot方法检测NS的表达。用NS特异性siRNA表达载体转染HeLa细胞，观察转染的HeLa细胞（简称NS-siRNA-HeLa细胞）体内外增殖的变化。结果：6种肿瘤细胞中NS明显高表达。体外培养的NS-siRNA-HeLa细胞中NS表达显著低于对照组，G0/G1期细胞百分率显著升高。体内致瘤实验显示，NS-siRNA-HeLa细胞在裸鼠体内增殖显著低于对照组。结论： NS在肿瘤细胞中高表达具有普遍性。NS特异性RNA干扰使HeLa细胞进入S期受阻，并可明显降低HeLa细胞体内外的增殖能力。     

小鼠血管内皮细胞表达人DAF和CD59对其心脏在人血清灌注下做功的影响

目的探讨联合转人衰变加速因子（DAF）和CD59基因对小鼠心脏在人血清灌注下做功及组织结构的影响。方法采用受精卵显微注射技术，将人DAF和CD59基因注入昆明小鼠受精卵的原核中，选取注射后仍健康的受精卵植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。提取足月产小鼠（G0代）基因组DNA，以聚合酶链反应（PCR）及Southern印迹杂交确定外源基因整合情况，应用流式细胞术检测人DAF和CD59在转基因小鼠白细胞上的表达，免疫组织化学染色检测人DAF和CD59在转基因小鼠心脏、肝脏及肾脏组织中的表达。取出转基因成功小鼠的心脏，在体外以人血清进行灌注，测定其做功能力，HE染色及免疫组化染色观察灌注后心脏的组织学变化以及补体C3c的沉积情况。以单一转DAF基因的小鼠为对照。结果共获得G0代小鼠135只，经PCR及Southern印迹杂交分析，11只（8．1%，11／135）整合有人DAF和CD59外源基因，其中6只的白细胞膜表面人DAF和CD59表达阳性，强度分别为（86±6）％和（85±8）%，单转人DAF基因者（87±7）%，差异无统计学意义。人DAF及CD59仅表达于转基因小鼠心脏、肝脏及肾脏组织中的血管内皮细胞上。在人血清灌注后60min内，普通小鼠的心脏做功急剧下降，接近40min时心脏停止搏动；转DAF基因小鼠的心脏做功也下降，但仍维持在最大值的20%以上；转DAF和CD59双基因小鼠的心脏做功维持在最大值的40％以上。在人血清灌注的10～60min，转基因小鼠心脏做功能力明显强于普通小鼠心脏（P〈0．05）；灌注20-60min时，转双基因小鼠的心脏做功能力明显强于转DAF基因小鼠心脏（P〈0．05）。普通小鼠心脏在人血清灌注后组织裂解较多见，肿胀严重，而转基因小鼠心脏组织的病理改变明显轻于普通小鼠，转双基因者的病理变化又明显轻于单一转DAF者，心肌血管中人C3c的沉积也明显少于单一转DAF者。结论血管内皮细胞特异性表达人DAF和CD59，可明显阻抑其心脏在异种血清灌注下的做功能力下降及C3c在血管中的沉积，这可能对抵御超急性排斥反应有一定帮助。     

淫羊藿总黄酮对体外培养的人成骨样细胞增殖和骨形成功能的影响

目的：研究淫羊藿总黄酮对人成骨样细胞增殖和骨形成功能的影响。方法：以人成骨样细胞OS-732为实验材料，进行细胞生长曲线的绘制、MTT测定、形态学观察、碱性磷酸酶(ALP)测定和染色等。结果：d3时，与对照组相比，加药组的细胞数目明显增加；d6时加药组的细胞数目仍多于对照组。MTT测定得到了类似的结果。加药后d4，加药组与空白对照组相比细胞数目多、形态大而规则，染色质深而致密，核质比小。ALP染色结果显示，加药组细胞ALP颗粒染色明显深于对照组，并且ALP颗粒在胞浆中的分布均匀。ALP的定量测定表明加药组ALP水平明显高于对照组。结论：淫羊藿总黄酮对体外培养的人成骨样细胞OS-732具有促增殖和分化作用，并表现出浓度依赖性。     

正常饮食中短期补充钙剂对双侧卵巢切除大鼠骨质量及骨代谢的影响

取24只SD大鼠，分A组：假手术组8只；B组：双侧卵巢切除组8只；C组：双侧卵巢切除 补钙组8只。实验前各组间体重差异无显著性。利用灌胃法对C组大鼠每天补L-苏糖酸钙1次，剂量为1．18mg元素钙／kg体重。5周后结束实验，眼角静脉取血作碱性磷酸酶、血钙和血磷等生化指标测定；取肝、肾、心脏等组织保存于甲醛中用于病理分析；取第2腰椎、右股骨，用于骨密度、骨矿含量和生物力学、骨干重灰重等测量。     

正常饮食中短期补充钙剂对双侧卵巢切除大鼠骨质量及骨代谢的影响

目的:研究正常饮食中短期内补充钙剂对卵巢切除大鼠骨质量和骨代谢的影响.方法:将25只SD大鼠分为3组,A组:假手术组(sham组),B组:双侧卵巢切除组(OVX组),C组:双侧卵巢切除 补钙组(OVX 补钙组).钙剂为L-苏糖酸钙,补钙剂量为45mg·kg-1·d-1. 5周后测各组大鼠骨密度、骨生物力学参数、矿盐含量及血清生化指标等.结果:①B组骨密度显著低于A组(P<0.05),C组与B组骨密度无显著性差别.②A和C组矿盐含量均较B组高(P<0.05),C组灰重较B组高(P<0.05).③B组血清P,Ca和ALP显著低于A组(P<0.01,P<0.01和P<0.05);C组血清P,Ca和ALP显著高于B组(P<0.05,P<0.01和P<0.01).结论:短期补钙对骨质疏松大鼠骨质量有一定程度的改善,但效果不十分明显;补钙对骨质疏松大鼠骨代谢有明显的影响,可明显地增强成骨活动.     

旋毛虫ES抗原基因的克隆和序列分析

目的　完成旋毛虫ES抗原 (Excretory -secretoryAntigen)中 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因的克隆和测序 ,并与已发表的该两种基因的相关序列比较、分析。方法　通过RT -PCR ,从旋毛虫幼虫总RNA中扩增得到特异性片段 ,利用TA克隆将PCR产物克隆入 pUC -T载体中并进行测序及同源性比较。 结果　RT -PCR扩增得到 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因 ,序列分析表明 ,其核苷酸序列与已发表的 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原的同源性均为 99%。结论　成功提取了旋毛虫幼虫的总RNA ,并用PT -PCR方法克隆了 4 3kDa分泌性糖蛋白基因和 5 3kDa分泌性抗原基因 ,这为两基因的表达及在医学、兽医学中应用研究奠定了基础。     

建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子的转基因小鼠

目的为了研究异种移植，建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子(DAF)的转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术，将含有人内皮细胞粘附分子-2(ICAM-2)基因启动子、人DAF cDNA(插有人DAF基因第一个内含子)、SV40splice／polyA的外源基因导人小鼠受精卵的原核中；选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链(PCR)技术及Southern印迹杂交法确定外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法和流式细胞术分别用于外源基因mRNA及蛋白质水平表达的检测。免疫组织化学方法观察人DAF在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官的表达分布。采用Langendorff心脏灌流装置，用200g／L的稀释人血清灌注转基因小鼠离体心脏，检测其抗超急性排斥反应能力。结果共产仔鼠133只，21只整合有外源基因，整合率16％(21／133)。8只实现mRNA及蛋白质水平表达，蛋白质水平表达强度为人DAF基因在人白细胞表达强度的70％至95％，转基因效率60A(8／133)。免疫组织化学法显示人DAF在转基因小鼠器官组织切片上有较强表达，且表达限于血管内皮细胞。与普通鼠对比，转基因小鼠离体心脏存活时间明显延长，且60min灌注期间内做功仍维持在最大值20％以上。结论成功地建立了血管内皮细胞组织特异性表达人DAF的转基因小鼠。这种小鼠有一定的抗超急性排斥反应能力。     

Nucleostemin 特异性RNA干扰对肿瘤细胞增殖能力的影响

目的：检测肿瘤细胞Nucleostemin(NS)的表达，研究NS特异性RNA干扰对Hela细胞体内外增殖的影响。方法：提取6种肿瘤细胞总RNA，用RT-PCR和Northern blot方法检测NS的表达。用NS特异性siRNA表达载体转染Hela细胞，观察转染的Hela细胞(简称NS-SiRNA-Hela细胞)体内外增殖的变化。结果：6种肿瘤细胞中NS显高表达。体外培养的NS-siRNA-Hela细胞中NS表达显降低，Gn／G，期细胞百分率显升高。体内致瘤实验显示，NS-siRNA-Hela细胞在裸鼠体内增殖显降低。结论：NS在肿瘤细胞中高表达具有普遍性。NS特异性RNA干扰使Hela细胞进入S期受阻，并可明显降低Hela细胞体内外的增殖能力。