AKR1C3酶抑制剂筛选模型的建立及在中药五环三萜类活性成分筛选中的应用

目的:建立与优化AKR1C3抑制剂类抗去势抵抗性前列腺癌药物筛选模型,并运用此模型对中药五环三萜类化合物进行体外活性筛选和构效关系分析。方法:优化酶催化反应的辅酶NADPH浓度、底物9,10-菲醌浓度、酶浓度、反应温度、预孵育时间等因素,建立AKR1C3酶抑制剂筛选模型,采用阳性对照药物甲氯酚那酸及雷公藤红素等6种五环三萜化合物验证模型的可靠性。结果:优化后的反应体系为:0.15 mmol/L辅酶NADPH、8μmol/L底物9,10-菲醌、0.33μmol/L酶,反应温度为30℃,预孵育时间和反应时间均为10 min。运用该模型测定的甲氯酚那酸的IC_(50)值为0.516μmol/L,与文献报道值相符。6种五环三萜类化合物中,雷公藤红素和甘草次酸对AKR1C3酶的抑制活性最强。结论:建立的模型可应用于AKR1C3抑制剂的筛选,并为靶向AKR1C3的抗去势抵抗性前列腺癌中药及中药复方活性成分的筛选和作用机制研究提供良好的技术平台。     

基于谱效-构效关系筛选大黄中酪氨酸酶活性抑制成分的方法研究

目的 建立一种基于谱效-构效结合的高效天然化合物活性筛选体系,并采用该体系筛选大黄中酪氨酸酶抑制剂.方法 根据酪氨酸酶催化底物发生反应的原理,以大黄为例依次经过不同极性溶剂提取,分别检测各极性提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用;针对活性组分通过UPLC-Q/TOF鉴定活性成分,采用计算机辅助药物设计评价构效关系,进一步筛选抑制剂分子,并结合酶学检测验证药效成分.结果 通过建立的谱效-构效结合筛选体系获得大黄中大黄素、藜芦酚-4'-O-β-D-葡萄糖苷等9种具有间二羟基苯酚、邻三羟基苯酚结构的化合物可能具有酪氨酸酶活性抑制作用.结论 大黄中大黄素和藜芦酚衍生物对酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用;谱效-构效相结合的筛选模式为天然化合物活性筛选提供了便捷方法.     

应用α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型筛选降血糖中药

 目的建立筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的体外高通量筛选模型,并对30味常用清热解表中药进行筛选。方法应用大鼠小肠上段提取的α-葡萄糖苷酶,以蔗糖作为底物,通过测定反应体系中葡萄糖的生成量来检测α-葡萄糖苷酶的活性。通过优化酶促反应条件,建立检测α-葡萄糖苷酶活性的比色测定法及其抑制剂体外筛选的方法,并对30味中药共72个样品进行高通量筛选。结果阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性与文献报道相近;筛选发现鸭跖草、山慈菇和桑叶等3味中药的不同极性提取物对α-葡萄糖苷酶有可重复的抑制作用。结论应用比色法建立的筛选模型可进行α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选及中药相关活性物质的发现。     

黄嘌呤氧化酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用

 目的建立适用于高通量筛选的黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase,XO)抑制剂筛选模型,并以此模型进行XO抑制剂筛选。方法建立XO活性的紫外检测法及其抑制剂体外高通量筛选模型,并用此筛选模型对71760化合物与粗提物进行筛选。结果通过对筛选条件优化,建立了可靠的筛选模型,并对71760样品进行了初筛,发现27个活性化合物,命中率0.038%,其中17个有较好量-效关系。结论建立了稳定灵敏的适用于高通量筛选的XO抑制剂体外筛选模型,并发现了一些具有较好活性的化合物。     

2-氰基-3,12-二氧齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-酸及其类似物的结构修饰研究进展简

 目的 综述2-氰基-3, 12-二氧齐墩果烷-1, 9(11)-二烯-28-酸(CDDO)的合成及其衍生物的A、C环, C-2和C-17位等位置的结构修饰及构效关系。方法 以近年来该领域的国内外文献为基础, 对2-氰基-3, 12-二氧齐墩果烷-1, 9(11)-二烯-28-酸及其衍生物的构效关系进行分析和总结。结果与结论 2-氰基-3, 12-二氧齐墩果烷-1, 9(11)-二烯-28-酸及其类似物构效关系的研究, 有助于我们更好地利用2-氰基-3, 12-二氧齐墩果烷-1, 9(11)-二烯-28-酸及其类似物, 并设计合成出活性和选择性更高的药物。     

Ⅳ型胶原酶模型的建立及其在中药活性成分筛选中的应用

目的建立Ⅳ型胶原酶筛选模型,并运用此模型对中药活性成分进行评价。方法利用Ⅳ型胶原酶特异性水解明胶释放的末端氨基与2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)发生显色,吸光度值可以衡量Ⅳ型胶原酶含量,优化Ⅳ型胶原酶浓度、琥珀酰凝胶浓度、显色剂用量及时间参数。结果确定了Ⅳ型胶原酶筛选模型的条件:5.0×10~(-5) g/L酶溶液、20 g/L琥珀酰凝胶溶液、60μl 0.05%TNBS、显色30 min,阳性药盐酸四环素在1.0 g/L下对该酶的抑制率是19.39%,并呈现一定的量效关系,表明成功建立该筛选模型。应用该模型筛选发现,阿魏酸和川芎嗪具有明显的抑制Ⅳ型胶原酶活性,而水杨酸和小檗碱则具有促进作用。结论Ⅳ型胶原酶的筛选模型成功建立并应用到中药活性成分筛选中,为快速评价中药活性成分及其作用机制提供了有益参考。     

基于支持向量回归和分子对接技术的中药CYP450 2E1抑制剂筛选

细胞色素P450酶(CYP450)的抑制是药物相互作用最常见的原因,对CYPs抑制剂早期预测的研究有助于减少药物相互作用导致的不良反应。CYP450 2E1(CYP2E1)是CYP450酶系中参与药物体内代谢的主要酶,具有广泛的药物代谢底物谱。该研究以CYP2E1为研究对象,基于32个CYP2E1抑制剂,建立支持向量回归模型(support vector regression,SVR),并用测试集数据对CYP2E1定量模型进行验证,获得CYP2E1抑制剂最优预测模型。该研究同时利用CDOCKER分析阳性化合物与活性口袋相互作用模式及氨基酸,建立CYP2E1抑制剂最优筛选模型。综合利用支持向量回归模型和分子对接预测模型筛选中药化学成分数据库(traditional Chinese medicine database,TCMD),提高了计算效率和结果的准确性。SVR预测模型初步得到6 376个中药化合物,通过分子对接进一步验证,最终获得247个对CYP2E1具有潜在抑制活性的中药化合物,其中部分已有实验证实其的确对CYP2E1具有抑制作用。该研究对CYP2E1酶抑制剂的研究可为CYP450抑制剂的虚拟筛选及其介导的药物不良反应预测提供指导,对临床合理用药提供一定的参考。     

紫杉醇类似物抗癌活性与分子结构的定量构效关系

目的为了寻找新一代紫杉醇类抗癌药物,研究紫杉醇类似物分子结构和抗癌活性(PIDact)之间的定量构效关系。方法基于电性状态拓扑指数和电性距离矢量,应用最佳子集回归的方法建立了PIDact值和紫杉醇类似物分子结构的定量结构–活性相关(QSAR)模型,并对模型进行了交互检验和外部检验,用43个紫杉醇类似物训练集样本构建的QSAR模型预测了外部10个检验集的PIDact值。结果所建立模型具有较高的估计相关系数及LOO(leave-one-out)检验相关系数。结论模型具有良好估计能力与稳定性,训练集模型具有良好预测能力。     

构建二肽基肽酶-IV抑制剂体外筛选模型及相关化合物抑制活性的测定

目的:建立二肽基肽酶-IV( DPP-IV)抑制剂体外筛选模型,并测定相关化合物的抑制率.方法:提取Caco-2细胞中DPP-IV,测定酶不同活力单位的吸光度(A),绘制活性-吸光度相关性曲线评价酶的活性与A的相关性;以sitagliptin为阳性对照测定其半抑制浓度( IC50)验证本实验模型;以该模型测定sitagliptin衍生物及对DPP-IV有抑制作用化合物的抑制活性.结果:酶的活性在一定范围内与A成直线相关;以本模型测定的sitagliptin lC50为18.354 nmol·L-1;JD-1,JD-2 IC50分别为3.4,2.6μmol·L-1,相关化合物的抑制率在21.45％～27.77％之间.结论:使用本DPP-IV抑制剂筛选模型测定的sitagliptin IC50与文献报道的相近,证明本模型的有效性,所测化合物有一定抑制活性.     

血管内皮生长因子受体-2抑制剂高通量筛选模型的建立和应用

 目的 利用均相时间分辨荧光(HTRF)技术建立血管内皮生长因子受体-2抑制剂高通量药物筛选模型,从化合物样品库中寻找小分子抑制剂。方法 使用20 μL检测体系,384低容量白板,采用均相时间分辨荧光技术对反应体系中的酶活性进行荧光检测,进而评价待测样品的抑制活性。模型建立的体系优化包括如下实验步骤：酶浓度及反应时间优化,ATP和底物米氏常数测定,质控实验包括反应体系信噪比实验、抑制剂SU5416的IC₅₀测定,Z′因子的测定。在建立稳定模型检测体系之后,对本中心化合物库提供的10 560个样品进行活性筛选,并对部分活性化合物进行IC₅₀的测定。结果 在血管内皮生长因子受体-2活性体系优化实验中求得血管内皮生长因子受体-2激酶最适反应酶浓度为0.10 ng·μL^-1,最适反应时间为15 min,ATP K_m=0.75 μmol·L^-1,底物K_m=94.90 nmol·L^-1,信噪比底物：SA=2∶1,Z′值为0.85,阳性药IC₅₀=1.03 μmol·L^-1。通过部分初筛活性样品进行复筛研究,得到3个活性化合物S2-14,S2-16、S2-38 IC₅₀分别为1.01×10^-4,6.04×10^-5,7.23×10^-6 mol·L^-1。结论 利用均相时间分辨荧光技术成功建立了血管内皮生长因子受体-2激酶高通量筛选模型,并进行了一定量的定向筛选研究,发现了若干先导化合物。本实验体系方法可靠,结果稳定,可作为抗血管新生天然产物筛选体系进行应用推广。     

一种非同位素5α-还原酶抑制剂体外筛选模型的建立和应用

目的:建立一种非同位素5α-还原酶抑制剂体外筛选模型.方法:从大鼠前列腺组织中提取物5α-还原酶,与底物睾酮(T)以及供氢体NADPH共同组成了一种微量反应体系.反应产物二氢睾酮(DHT)用酶免技术(EIA)测定,以产物生成量确定酶活性;对反应底物、NADPH、酶浓度以及反应最佳温度和时间进行了优化.结果:当底物、NADPH、酶提取物浓度分别为0.25μM、1mM和0.3mg,37℃反应60分钟可获最大酶活性.特异性5α-还原酶抑制剂非那雄胺显著降低5α-还原酶催化产物DHT的生成.进一步对24种中药进行筛选,姜黄、夏枯草等中药提取物具有5α-还原酶抑制剂作用.结论:本文建立的非同位素方法有效、可行,可作为一种体外模型筛选和研究5α-还原酶抑制剂.     

缺氧诱导因子-1抑制剂细胞筛选模型的 建立及抑制剂研究

目的:建立并应用2种缺氧诱导因子-1(HIF-1)抑制剂细胞筛选模型对雷公藤甲素和三白脂素-8活性进行评价,为HIF-1靶点抑制剂的研发提供基础。方法:建立基于报告基因的HIF-1抑制剂细胞筛选模型,U251-HRE和T47D-HRE细胞模型,分别对雷公藤甲素与三白脂素-8活性进行检测,观察其对下游关键调控基因VEGF表达的影响,并用MTT法比较2类抑制剂对多种实体瘤细胞的增殖抑制活性。结果:2种细胞模型在1%O2缺氧20 h,由HIF-1诱导的荧光素酶高表达,可用于抑制剂的活性评价。雷公藤甲素对U251-HRE细胞模型敏感,其HIF-1抑制活性IC50(3.4±0.5)×10-8mol.L-1,而三白脂素-8对T47D-HRE细胞模型敏感,其IC50(2.4±0.6)×10-8mol.L-1;雷公藤甲素和三白脂素-8在1×10-7mol.L-1都可对T47D细胞因缺氧所致的VEGF表达升高产生明显抑制作用,其抑制率分别为85.2%,62.6%;雷公藤甲素对所测肿瘤细胞株都有明显的增殖抑制活性,而三白脂素-8对乳腺癌、胰腺癌细胞株较为敏感。结论:针对不同类别的HIF-1抑制剂建立相应敏感的特异性细胞筛选模型至关重要。     

昆明山海棠内生真菌α-糖苷酶抑制活性的筛选及菌株鉴定

目的:评价昆明山海棠内生真菌α-糖苷酶抑制活性。方法:以昆明山海棠分离所得的98株内生真菌为研究对象,通过建立体外α-糖苷酶抑制剂筛选模型,以阿卡波糖为阳性药,对分离自昆明山海棠的98株内生真菌发酵液正丁醇提取物进行活性筛选,并对活性菌株Th F-63进行鉴定。结果:在底物4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)浓度为2.5 mmol·L-1,酶浓度0.8 U·m L-1,反应时间15 min条件下,98株内生真菌中,15株菌正丁醇提取物表现出α-糖苷酶抑制活性(IC5030 g·L-1),Th F-63最为显著(IC501.034 g·L-1),且呈现浓度依赖性关系;经ITS鉴定活性菌株Th F-63为链革孢属真菌(Alternaria)。结论:昆明山海棠内生真菌中筛选出具有抑制α-糖苷酶作用的菌株链革孢属真菌(Alternaria)。     

天然来源的人类免疫缺陷病毒1整合酶抑制剂

 目的简要介绍天然来源的人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)整合酶抑制剂以及几个研究热点化合物的性质、特点和构效关系。方法以国内外的研究为依据,对HIV-1整合酶的天然抑制剂进行分类综述,简要介绍几个研究热点化合物的性质、特点和构效关系。结果与结论根据化学结构,将HIV-1整合酶的天然抑制剂分为酮类、酚类、生物碱类、萜类以及蛋白和多肽类。以天然抑制剂及现有合成药物的结构特征和活性为指导,通过化学改造,有望获得更有效乃至选择性更强的HIV-1整合酶抑制剂。     

基于神经兴奋-抑制因子(Glu-GABA)受体含量及表达观察电针对于脑卒中痉挛状态大鼠黑质纹状体的影响实验研究

目的通过动物实验分析电针治疗对脑卒中痉挛状态下SD大鼠大脑神经兴奋因子谷氨酸与神经抑制因子γ-氨基丁酸含量及其相关活性基因表达的影响,来探讨电针缓解SCA(脑卒中痉挛状态)的疗效及其作用机制。方法每组8只,将32只SD大鼠随机分为电针组(模型+电针阳陵泉、曲池)、假手术组、模型组、空白组。运用在大脑中动脉线栓法制作SCA模型,行为学评分确认模型成功后开始与电针治疗,连续3天。酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测黑质中谷氨酸Glu、γ-氨基丁酸GABA及其相关受体(GluR、GABAR)的含量,并通过RT-PCR检测黑质中谷氨酸基因mGluR1amRNA与γ-氨基丁酸基因GABABR1mRNA的相应表达。结果 (1)电针治疗前,模型组、电针组同空白组、假手术组进行比较显示,肌张力评分明显升高,统计学意义显著(P0.01);之后在电针治疗与电针治疗前肌张力评分差异明显,统计学有意义(P0.01)。(2)电针组同模型组比较谷氨酸及其受体含量明显降低(P0.01);而模型组与空白组、假手术组比较谷氨酸及其受体的含量均明显升高(P0.01)。(3)电针组同模型组比较γ-氨基丁酸及其受体含量均升高(P0.05);而模型组与空白组、假手术组比较γ-氨基丁酸及其受体含量均降低(P0.05)。(4)观察谷氨酸mGluR1amRNA表达的变化电针组与模型组比较相关基因表达明显减少(P0.01);模型组与空白组、假手术组比较表达明显增高(P0.01);而观察γ-氨基丁酸GABABR1mRNA表达的变化,电针组与模型组比较相关基因表达明显增加(P0.01);模型组与空白组、假手术组比较表达明显降低(P0.01)。结论通过电针治疗可以从谷氨酸和γ-氨基丁酸的基因、受体及其活性因子全面的调节,使大脑黑质内的Glu低表达和GABA的高表达,从而使病态的中枢神经系统的功能趋于恢复正常,证明了电针对脑卒中痉挛状态具有良好的治疗效果。     

缬草挥发油对戊四氮致癫痫大鼠海马内γ-氨基丁酸和谷氨酸含量的影响

目的:研究缬草挥发油对戊四氮致癫痫大鼠海马内兴奋性与抑制性氨基酸含量的影响,探讨其抗癫痫的可能机制。方法:采用腹腔注射戊四氮建立大鼠癫痫模型,观察经缬草挥发油治疗后的癫痫大鼠与对照组大鼠海马内γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)含量的变化。结果:经缬草挥发油治疗后的癫痫大鼠与对照组大鼠海马内的γ-氨基丁酸含量明显升高,谷氨酸显著降低(P<0.05)。结论:缬草可调节癫痫大鼠脑内的兴奋性与抑制性氨基酸的平衡,从而起到抗癫痫的作用。     

舒郁胶囊对经前期综合征肝气郁证大鼠顶区皮层GABA-T、GAT-1表达的影响

目的探讨舒郁胶囊治疗经前期综合征(PMS)肝气郁证的可能作用机制。方法将60只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、舒郁胶囊组、氟西汀组、柴胡皂苷组,每组12只。除空白组外,各组大鼠均于动情周期行四肢对侧捆缚术造模。造模同时,舒郁胶囊组给予舒郁胶囊0.408 g/(kg·d)、氟西汀组给予盐酸氟西汀胶囊2.67 mg/(kg·d)、柴胡皂苷组给予柴胡皂苷提取物0.72 mg/(kg·d),空白组与模型组给予等体积无菌水灌胃,连续灌胃8天。给药后称量大鼠体重,进行旷场实验采集旷场实验总路程,并取大鼠顶区皮层组织检测γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)、γ-氨基丁酸转运体-1(GAT-1)蛋白和mRNA表达情况。结果与空白组相比,模型组大鼠体重下降、旷场实验总路程减少(P0.05),顶区皮层GABA-T、GAT-1蛋白和mRNA表达显著升高(P0.05);与模型组相比,氟西汀组、舒郁胶囊组大鼠体重增长、旷场实验总路程增长(P0.05),顶区皮层GABA-T、GAT-1蛋白及mRNA的表达显著下降(P0.05)。结论舒郁胶囊可能通过纠正GABA-T、GAT-1的异常表达调节GABA代谢失常而发挥治疗PMS肝气郁证的作用。     

应用体外模型从植物提取物中筛选治疗雄激素源性脱发的5a-还原酶抑制剂

目的应用5a-还原酶抑制剂体外筛选模型,寻找植物提取物中天然5a-还原酶抑制剂,用于雄激素源性脱发的治疗。方法通过HPLC测定底物睾酮(T)在酶促反应中的下降速率计算酶活力,建立5a-还原酶抑制剂体外筛选模型。采用此体外模型对多种植物提取物进行酶抑制作用筛选,继而对筛出的植物提取物采用制备液相进行组分分离制备,测定各段组分酶抑制活性,最终找出具有酶抑制作用的活性成分。结果通过体外模型筛选发现有酶抑制活性的咖啡提取物,并找到其活性成分咖啡鞣酸。结论通过体外模型筛选5a-还原酶抑制剂,结合制备液相分离植物提取物组分,是发现新活性物质的有效手段     

龙眼叶化学成分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性及构效关系研究

目的研究龙眼叶中各化学成分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性及其构效关系。方法采用微孔板法,以PNPG(对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)为底物比较龙眼叶中各化学成分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果龙眼叶乙酸乙酯部位的没食子酸乙酯、山柰酚、木犀草素、槲皮素、紫云英苷和石油醚部位的羽扇豆醇对α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制活性,化学成分两两和三三配伍后对α-葡萄糖苷酶抑制活性提高。结论龙眼叶乙酸乙酯部位化学成分对α-葡萄糖苷酶有较高的抑制活性,其抑制活性与结构密切相关,C环上C3位的取代基种类和数目可能影响黄酮类化合物抑制α-葡萄糖苷酶活性。     

β淀粉样肽聚集抑制剂体外筛选模型的建立及木栓酮抑制活性研究

 目的从天然药物中筛选β淀粉样肽聚集抑制剂。方法建立β淀粉样肽聚集抑制剂筛选模型的酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法,同时使用刚果红结合试验和硫磺素T分析试验对部分中草药提取物进行活性筛选,并对活性部位进行分离跟踪。结果灯盏细辛乙醇提取物显示β淀粉样肽聚集抑制活性,经跟踪分离测定发现其所合成分木栓酮为抑制作用活性成分。结论成功地建立了一种基于ELISA原理的β淀粉样肽聚集抑制剂筛选模型;用该模型筛选到灯盏细辛提取物及其所含化学成分木栓酮具有抑制β淀粉样肽体外聚集的活性。