金复康口服液诱导肺癌细胞A549凋亡的机制

目的:研究金复康口服液(JFK)诱导人非小细胞肺癌细胞A549凋亡的作用机制。方法:取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549,随机分为空白组和药物组,采用溴化四甲基偶氮(MTT)比色法,考察不同质量浓度JFK(0.3,1.5,3,7.5,15,30 g·L~(-1))对A549细胞体外增殖能力的影响。通过平板克隆形成实验考察JFK对A549细胞平板克隆形成的影响,利用流式细胞仪考察JFK对A549细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)考察JFK对裂解DNA修复酶(cleaved PARP),活化型半胱天冬酶-3(actived Caspase-3),Wnt/β-联蛋白(β-catenin),细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达及对促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响,实验中设置空白组和药物组,药物组为A549细胞加入15,30 g·L~(-1)JFK,分别干预24 h,30 min。结果:JFK在1.5~30 g·L~(-1)呈质量浓度依赖性的抑制A549细胞外增殖(P0.01)。JFK抑制A549细胞的平板克隆形成在15~30 g·L~(-1),其中JFK 30 g·L~(-1)时抑制A549细胞的平板克隆最显著(P0.01)。与空白组比较,JFK 15~30 g·L~(-1)可提高AnnexinⅤ和PI双阳细胞率,诱导A549细胞凋亡(P0.05),且呈浓度依赖性提高cleaved PARP和actived Caspase-3的蛋白表达,并抑制β-catenin和cyclin D1在蛋白水平的表达(P0.05,P0.01)。JFK上调MAPK信号通路中JNK和p38的蛋白磷酸化水平(P0.05),同时下调Akt信号通路中Akt在T308和S473的位点磷酸化水平(P0.05)。结论:金复康口服液抑制人非小细胞肺癌细胞A549的体外增殖、平板克隆的形成并诱导其凋亡,部分通过调控JNK/p38/MAPK信号通路和Akt信号通路,抑制β-catenin和cyclin D1,同时提高凋亡相关蛋白cleaved PARP和actived Caspase-3的表达。     

冠心止痛胶囊阻断MAPK信号通路改善棕榈酸诱导血管内皮细胞损伤的研究

为了研究冠心止痛胶囊(GXZT)对血管内皮细胞脂毒性损伤的影响,探索GXZT防治动脉粥样硬化可能的作用机制,该实验用棕榈酸(palmitic acid, PA)刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)复制脂毒性损伤模型,将细胞分为正常对照组(NC,15%正常血清)、模型组(PA,0.6 mmol·L~(-1) PA+15%正常血清)、GXZT高剂量组(GXZT-H,0.6 mmol·L~(-1) PA+15%GXZT血清)、中剂量组(GXZT-M,0.6 mmol·L~(-1) PA+10%GXZT血清+5%正常血清)和低剂量组(GXZT-L,0.6 mmol·L~(-1) PA+5%GXZT血清+10%正常血清)。用CCK-8法检测不同组HUVEC的细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1荧光探针标记后用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP),Western blot检测丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路关键蛋白p38、ERK1/2、JNK1/2总蛋白和磷酸化蛋白表达,并计算蛋白的磷酸化水平。实验结果显示,与NC组相比,PA组的细胞活力和MMP显著降低(P0.01,P0.01),细胞凋亡率显著增加(P0.01),MAPK信号通路p38、ERK1/2、JNK1/2的磷酸化水平显著增加(P0.01,P0.01,P0.01)。与PA组相比,GXZT-H、GXZT-M、GXZT-L的细胞活力和MMP均显著升高(P0.01,P0.01,P0.01),细胞凋亡率显著降低(P0.01),p38、ERK1/2、JNK1/2 MAPK信号通路的磷酸化蛋白表达减少,磷酸化水平显著降低(P0.01,P0.01,P0.01)。综上所述,GXZT 3个剂量组均可改善PA诱导的HUVEC脂毒性损伤,其机制可能是通过阻断MAPK信号通路减少内皮细胞凋亡而发挥作用。     

基于JNK通路探讨调更汤对GT1-7下丘脑神经元细胞凋亡的保护作用

目的:研究调更汤通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路改善下丘脑神经元细胞凋亡的作用机制。方法:采用下丘脑神经元细胞GT1-7细胞株,以三丁基氯化锡(TBTC)诱导模拟神经元细胞凋亡模型作为模型组(1 mg·L~(-1)),以17β-雌二醇(17β-E_2)为阳性药物作为17β-E2组(100 nmol·L~(-1)),调更汤低、中、高剂量组(31. 25,62. 5,125 mg·L~(-1))进行干预。以倒置荧光显微镜观察细胞形态学变化;细胞增殖毒性(CCK-8)法检测细胞活力; Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核的形态改变;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染色法检测下丘脑神经元细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测JNK通路凋亡相关蛋白凋亡信号调节激酶1(ASK1),JNK,p53,活化半胱氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)表达水平及JNK抑制剂SP600125干预后磷酸化JNK(p-JNK),cleaved Caspase-3的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组细胞活力显著降低(P 0. 01),细胞凋亡率显著升高(P 0. 01),JNK通路相关蛋白磷酸化ASK1(p-ASK1),p-JNK,磷酸化p53(p-p53),cleaved Caspase-3的表达显著增加(P 0. 01)。与模型组比较,调更汤显著改善GT1-7细胞活力(P 0. 01),降低细胞凋亡率(P 0. 01),调节p-ASK1,p-JNK,p-p53,cleaved Caspase-3蛋白的表达;高剂量调更汤联合应用SP600125(10μmol·L-1)处理后,更显著的抑制GT1-7细胞p-JNK,cleaved Caspase-3的蛋白表达(P 0. 01)。结论:调更汤通过JNK通路改善下丘脑神经元细胞凋亡,为调更汤治疗绝经综合征和中枢神经保护作用提供理论依据。     

斑蝥素对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其可能机制

目的:探讨不同浓度斑蝥素(cantharidin,CTD)对肝癌细胞HepG2细胞增殖、凋亡以及其可能机制。方法:应用长时间细胞观察及功能分析系统(IncuCyte~(TM) ZOOM)以及克隆形成实验,分析药物处理后肝癌细胞HepG2细胞增殖的影响。应用流式细胞术检测CTD对肝癌细胞HepG2凋亡的影响。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测技术,检测CTD处理后,HepG2细胞pro半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)蛋白表达的变化以及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2),蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平的变化。采用长时间细胞观察及功能分析系统检测ERK1/2抑制剂(PD98059),磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂(Wortmannin)与CTD共处理对HepG2细胞抑制作用的变化。结果:CTD在2.5μmol·L~(-1)时就能够明显抑制HepG2细胞的生长,但不出现明显凋亡。CTD 5μmol·L~(-1)时HepG2的生长几乎完全受到抑制,流式细胞术结果显示,HepG2细胞凋亡率达40.4%。同时Western blot结果显示CTD 5μmol·L~(-1)组细胞pro Caspase-3蛋白表达明显降低,Cleaved PARP蛋白表达明显上升,说明CTD 5μmol·L~(-1)组会出现细胞凋亡,与流式结果相符。CTD能够促进ERK磷酸化,但不能促进Akt磷酸化。结论:CTD 2.5μmol·L~(-1)具有抑制HepG2细胞生长的作用,5μmol·L~(-1)时能够促进HepG2细胞凋亡,提示CTD既具有抑制细胞生长作用,也具有一定的细胞毒作用。CTD能够促进ERK磷酸化,但不能促进Akt磷酸化。     

自噬对双去甲氧基姜黄素诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用的影响

目的:探讨自噬对双去甲氧基姜黄素诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用的影响。方法:以24 mg·L~(-1)双去甲氧基姜黄素或联合5 mol·L~(-1)自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对HepG2细胞作用24,48 h,以四甲基偶氮唑盐(methye thiazolye telrazlium,MTT)比色法检测细胞活力;以24 mg·L~(-1)双去甲氧基姜黄素单用或联合3-MA对HepG2细胞作用48 h,Hoechst 33342染色倒置荧光显微镜观察细胞凋亡形态,磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annxin V/propidium iodide,PI)双染检测细胞凋亡率,罗丹明123(Rhodamine 123,Rh123)染色检测线粒体膜电位,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白Beclin-1,LC3,半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)的活性表达。结果:与空白组比较,双去甲氧基姜黄素可抑制HepG2细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低线粒体膜电位,使pro-Caspase-3,Bcl-2,LC3-Ⅰ蛋白表达降低(P0.01),升高cleaved Caspase-3,Bax,Beclin-1,LC3-Ⅱ蛋白的表达(P0.01);3-MA可增强双去甲氧基姜黄素所诱导的HepG2细胞凋亡,提高凋亡率(P0.01),增加其降低线粒体膜电位作用(P0.01),明显下调pro-Caspase-3,Bcl-2蛋白的表达(P0.01),并上调Beclin-1,LC3,cleaved Caspase-3蛋白的表达(P0.01)。结论:双去甲氧基姜黄素可经线粒体机制诱导HepG2细胞凋亡,并诱导细胞自噬,自噬对凋亡有抑制作用。     

六神丸和雄黄诱导子宫内膜癌细胞凋亡和DNA损伤的机制

目的:比较经典名药六神丸和雄黄(As_4S_4)对子宫内膜癌细胞JEC的抗肿瘤作用及其机制。方法:原子吸收法测定六神丸与As_4S_4中砷(As)的溶解度;噻唑蓝(MTT)比色法比较六神丸与As_4S_4对细胞增殖的抑制作用,细胞迁移实验比较六神丸与As_4S_4对细胞迁移的抑制作用;磷脂酰丝氨酸蛋白抗体/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染结合流式细胞术比较六神丸与As_4S_4对细胞凋亡的影响,蛋白免疫印迹法(Western blot)比较六神丸与As_4S_4对凋亡和DNA损伤相关蛋白的影响。结果:原子吸收法测定结果显示六神丸的As溶出量为17. 4%,As_4S_4的As溶出量仅为1. 6%。但在相同As含量的情况下,与As_4S_4组比较,六神丸3,10 mg·L~(-1)组的细胞存活率明显降低(P0. 05),六神丸0. 25,0. 5,1 mg·L~(-1)组早期凋亡率明显增高(P0. 05),六神丸1 mg·L~(-1)组细胞迁移率明显下降(P0. 05),六神丸1 mg·L~(-1)组剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3),剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7(cleaved Caspase-7),剪切的聚ADP核糖聚合酶(cleaved PARP)以及磷酸化的组蛋白(p-H2AX),磷酸化的检测点激酶2(p-CHK2),人共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)蛋白表达水平升高(P0. 05),人共济失调毛细血管扩张症Rad3相关激酶(ATR)蛋白表达水平降低(P0. 05),而Caspase-3和Caspase-7蛋白表达水平无明显改变。结论:在等As剂量下,六神丸与As_4S_4均能抑制JEC细胞的增殖和迁移,诱导细胞凋亡和DNA损伤,但六神丸的效果优于As_4S_4,提示中药复方六神丸中还有其他成分协同As共同参与抗肿瘤作用。     

忍冬藤提取物诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用及机制研究

目的研究忍冬藤Lonicerajaponica提取物对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的作用及机制。方法采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF/MS)表征忍冬藤提取物的化学成分;采用MTT法检测忍冬藤提取物对人骨肉瘤细胞HOS、143B以及人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2存活率的影响;采用荧光显微镜观察忍冬藤提取物对HOS、143B细胞凋亡的影响;采用Annexin V/PI双染法检测忍冬藤提取物对HOS细胞凋亡的影响;采用JC-1染色法检测忍冬藤提取物对HOS细胞线粒体膜电位的影响;采用Westernblotting法检测忍冬藤提取物对HOS细胞B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(bcl-2associated X,Bax)、B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、活化的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleavedpolyADP-ribosepolymerases,cleavedPARP)、cleavedCaspase-9和细胞色素C(cytochrome-c,Cyt-C)蛋白表达的影响。结果忍冬藤提取物中鉴定出有机酸类、三萜皂苷类、黄酮类、环烯醚萜类和氨基酸类5种类型的36种化学成分。忍冬藤提取物抑制HOS和143B细胞存活率,显著诱导HOS细胞凋亡(P0.01),Caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK显著抑制忍冬藤提取物诱导的HOS细胞凋亡(P0.05、0.01);忍冬藤提取物显著提高HOS细胞Caspase-3活性(P0.01),显著改变HOS细胞线粒体膜电位(P0.05、0.01),显著上调HOS细胞Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9、Cyt-C和Bax/Bcl-2蛋白表达水平(P0.05、0.01),显著下调Bcl-2蛋白表达水平(P0.05、0.01)。结论忍冬藤提取物能够抑制骨肉瘤细胞增殖,并通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表达,激活Caspase级联反应有关。     

血府逐瘀胶囊对子宫内膜细胞炎症模型影响的研究

目的:探讨血府逐瘀胶囊对子宫内膜细胞炎症模型影响的实验研究。方法:通过酶消化法获得原代子宫内膜细胞,脂多糖(LPS)诱导炎症模型,后实验随机分为5组,正常对照组,模型组(100μg·m L~(-1)LPS),血府逐瘀胶囊低、中、高剂量组(10、30、100μg·m L~(-1)血府逐瘀胶囊)。MTT法检测各组细胞活力,酶联免疫吸附法检测各组细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL~(-1)β)、IL-6、IL-8蛋白含量,免疫印迹法检测各组细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9),环氧化二酶(COX-2)蛋白表达量及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平,反转录聚合酶连锁反应检测p38 MAPK mRNA含量。结果:与正常组比较,模型组中细胞活力下降,TNF-α、IL~(-1)β、IL-6、IL-8、MMP-9及COX-2蛋白表达量都显著提高(P0.01),p38 MAPK磷酸化水平提高(P0.01),p38 MAPK mRNA表达量显著提高(P0.01);与模型组比较,血府逐瘀胶囊低、中、高剂量组中细胞活力下降,TNF-α、IL~(-1)β、IL-6、IL-8水平都显著降低(P0.01),p38 MAPK mRNA表达量显著降低(P0.01);血府逐瘀胶囊中、高剂量组中MMP-9及COX-2蛋白表达量及p38 MAPK磷酸化水平下调(P0.01)。结论:血府逐瘀胶囊能显著抑制LPS诱导的子宫内膜细胞炎症,与降低炎症因子表达及p38 MAPK信号通路有关。     

甘草查尔酮A通过调控MAPK信号通路抑制MH7A细胞增殖并诱导凋亡

目的:探讨甘草查尔酮A(licochalcone A,LCA)对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖和凋亡以及相关炎性因子的影响,并揭示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与LCA调控MH7A细胞增殖和凋亡的关系。方法:培养MH7A细胞,将细胞分为空白组,LCA各浓度给药组(10,20,40μmol·L~(-1));采用噻唑蓝(MTT)比色法和DAPI染色检测MH7A细胞增殖情况;PI染色和流式细胞仪检测MH7A细胞周期,Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测MH7A细胞凋亡情况。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测LCA对炎症因子白细胞介素-1β(IL~(-1)β)mRNA的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测LCA对MAPK信号通路关键蛋白的影响,同时应用细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂PD98059处理,观察磷酸化(p)-ERK和IL~(-1)β蛋白表达水平。结果:与空白组比较,LCA能剂量依赖性抑制MH7A细胞增殖,活细胞数量显著减少(P0.01),而进入细胞周期早期凋亡的细胞数量显著增多(P0.01)。此外,与肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10μg·L~(-1))组比较,LCA能剂量依赖性逆转TNF-α导致的炎症因子IL~(-1)βmRNA表达的升高(P0.01)。与空白组比较,LCA能剂量依赖性的促进MAPK信号通路中关键蛋白ERK,氨基末端激酶(JNK)和p38的磷酸化表达(P0.01)。与PD98059组比较,ERK的剂量依赖性磷酸化作用被抵消,同时LCA 10,20μmol·L~(-1)对IL~(-1)β的抑制作用消失。结论:LCA能抑制MH7A细胞增殖和诱导其凋亡,可能与其促进MAPK通路相关蛋白磷酸化的表达继而抑制炎症因子的表达有关。     

抗体芯片筛选黄芩苷诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用靶点

目的采用凋亡抗体芯片筛选黄芩苷诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用通路和靶点,探讨黄芩苷诱导胃癌细胞凋亡的相关机制。方法采用MTT法检测黄芩苷对SGC-7901细胞的增殖抑制作用;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用人凋亡抗体芯片双抗体夹心检测法筛选出黄芩苷(120μmo L·L~(-1))组与对照组的差异表达蛋白;采用Western Blot法对筛选出的差异蛋白Caspase-3、Caspase-8、Fas L、XIAP进行验证,增加对Fas、Caspase-9、TRAIL蛋白的检测。结果与对照组比较,20~320μmo L·L~(-1)的黄芩苷在24~96 h不同时间点可抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖(P0.05,P0.01,P0.001),且呈浓度和时间依赖性;80,120,160μmo L·L~(-1)黄芩苷均可诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡(P0.01),且呈浓度依赖性;凋亡抗体芯片检测结果表明,120μmo L·L~(-1)黄芩苷组的bad、Caspase-3、Caspase-8、Fas L、HSP60、TRAIL R4、IGF-I、IGF-II、p21、p27、p53和SMAC等蛋白表达明显上调,而XIAP蛋白表达显著下调,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。Western Blot验证实验结果表明,160μmo L·L~(-1)浓度组的Fas L蛋白相对表达量显著上升(P0.001);120,160μmo L·L~(-1)浓度组的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Fas、TRAIL蛋白相对表达量显著上升(P0.01,P0.001),XIAP蛋白相对表达量显著下调(P0.001)。结论黄芩苷诱导胃癌细胞凋亡的抗肿瘤作用机制与Fas L、TRAIL介导的死亡受体有关;抗体芯片是有效的靶点筛选手段,可用于药物作用靶点和药理机制研究。     

疣毒净诱导H8细胞凋亡作用机制

目的:观察疣毒净制剂对人宫颈永生化细胞H8细胞增殖和凋亡的影响,探讨其可能的作用机制。方法:以转染HPV16基因后稳定传代的人宫颈永生化细胞株H8细胞为研究对象;经1,2,3,4,5 g·L~(-1)疣毒净干预H8细胞24,48,72 h,同时设立空白组,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖抑制作用;荧光显微镜下观察1,2,3,4,5 g·L~(-1)疣毒净干预24 h后,经Hoechst 33342染色的细胞凋亡情况;流式细胞仪检测1,2,3,4,5 g·L~(-1)疣毒净干预24 h后,经Annexin V/碘化丙啶(PI)双染后细胞早期凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测1,2,3,4,5 g·L~(-1)疣毒净干预24 h后H8细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)蛋白表达情况。结果:与空白组比较,2,3,4,5 g·L~(-1)疣毒净对H8细胞的生长抑制呈明显的浓度-时间依赖效应(P0.05);经Hoechst 33342染色后,荧光显微镜下可见1,2,3,4,5 g·L~(-1)疣毒净给药后细胞均出现明显的核染色质浓缩,3,4,5 g·L~(-1)疣毒净干预下圆形亮蓝色凋亡小体逐渐增多;流式细胞仪检测到1,2,3 g·L~(-1)疣毒净干预24 h后细胞的早期凋亡率分别为(23.73±5.72)%,(63.9±3.59)%,(71.53±1.59)%,与空白组(6.53±0.85)%比较早期凋亡率显著升高(P0.01);与空白组比较,疣毒净组凋亡执行蛋白Caspase-3及其底物PARP蛋白均明显下调(P0.05),呈浓度下调趋势,二者下调的趋势一致。结论:疣毒净能明显抑制宫颈永生化细胞H8细胞增殖,诱导早期凋亡,可能是通过激活Caspase-3-PARP途径来执行的。     

甘草苷对中波紫外线诱导人皮肤角质形成细胞凋亡的影响

目的:研究甘草苷对中波紫外线(UVB)诱导人皮肤角质形成细胞(Ha Ca T)凋亡的影响。方法:以不同浓度的甘草苷作用于Ha Ca T细胞,噻唑蓝(MTT)比色法筛选甘草苷的有效安全浓度;用30 m J·cm-2的UVB作用于Ha Ca T细胞,建立光老化模型,MTT比色法检测光老化Ha Ca T细胞增殖率;流式细胞术检测各组细胞中活性氧自由基(ROS)含量和总凋亡率;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测光老化Ha Ca T细胞中半胱氨酸天冬氨酸-3(Caspase-3),半胱氨酸天冬氨酸-9(Caspase-9)mRNA表达水平;蛋白免疫印记法(Western blot)检测光老化Ha Ca T细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Caspase-3,Caspase-9蛋白表达量。结果:筛选出甘草苷的最佳有效安全浓度为1×10-7,1×10-6,1×10-5mol·L-1。与空白组比较,UVB组细胞增殖率显著降低(P0.01),细胞中ROS含量和总凋亡率显著升高(P0.01),Caspase-3,Caspase-9 mRNA表达水平显著升高(P0.01);Bcl-2蛋白表达量显著降低(P0.01),Caspase-3,Caspase-9蛋白表达量显著升高(P0.01)。与UVB组比较,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol·L-1甘草苷+UVB组细胞增殖率显著升高(P0.01);细胞中ROS含量和总凋亡率显著降低(P0.05,P0.01),Caspase-3,Caspase-9 mRNA表达水平显著降低(P0.05,P0.01);Bcl-2蛋白表达量显著升高(P0.05,P0.01),Caspase-3,Caspase-9蛋白表达量显著降低(P0.05,P0.01)。结论:甘草苷能通过促进抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达,减少促凋亡相关细胞因子Caspase-3,Caspase-9 mRNA和蛋白的表达,从而抑制UVB诱导的Ha Ca T细胞凋亡。     

养正散结汤对人胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡及ERK通路的影响

目的:探讨养正散结汤对人胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路的影响。方法:将养正散结汤组(0. 5,1,1. 5,2,2. 5,3,3. 5 g·L~(-1))作用于胃癌MKN-45细胞,设置空白组,分别孵育24,48,72 h后采用细胞增殖活性检测方法(CCK-8)检测细胞增殖情况;用养正散结汤组(0. 4,0. 8 g·L~(-1))处理细胞,运用平板克隆形成实验观察细胞的克隆形成能力;用4,8 g·L~(-1)养正散结汤干预细胞,利用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;用2,4,8 g·L~(-1)养正散结汤处理细胞,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测ERK表达及其磷酸化水平。结果:与空白组比较,养正散结汤组能明显抑制MKN-45细胞的增殖,处理24,48 h后,养正散结汤从2 g·L~(-1)开始,处理72 h后,从1. 5 g·L~(-1)开始,细胞存活率逐渐降低,呈明显浓度依赖性(P 0. 05,P 0. 01)。经不同质量浓度的养正散结汤干预48 h后,养正散结汤组细胞克隆形成率显著低于空白组(P 0. 01),呈一定的量效关系,0. 8 g·L~(-1)养正散结汤干预后,MKN-45细胞集落基本无法形成;养正散结汤组细胞凋亡率明显高于空白组(P 0. 05,P 0. 01);干预12 h后,与空白组比较,养正散结汤从4 g·L~(-1)开始下调MKN-45细胞中ERK蛋白的磷酸化水平(P 0. 01)。结论:养正散结汤能抑制人胃癌细胞MKN-45的增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与抑制ERK的磷酸化有关。     

肝癌全方及其不同治法拆方抑制SMMC7721人肝癌细胞增殖的作用

目的:探讨肝癌全方及不同治法拆方抗肿瘤作用的分子机制。方法:体外培养SMMC7721人肝癌细胞,分别给予2.5~100 g·L-1肝癌全方、清热方、活血方、健脾方干预24 h后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖;分别采用1.25~20 g·L-1肝癌全方,5~20 g·L-1清热方和活血方及20~120 g·L-1健脾方干预24 h后,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测相关基因的表达;分别采用20 g·L-1肝癌全方和清热方,10 g·L-1活血方及120 g·L-1健脾方干预SMMC7721细胞24 h后,通过蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达,通过碘化丙啶(PI)/RNase staining solution试剂染色检测细胞周期的改变。结果:与空白组比较,肝癌全方及其不同治法拆方能抑制SMMC7721细胞的增殖,并呈现量效关系(P0.05)。与空白组比较,5~20 g·L-1清热方呈现量效抑制细胞周期依赖性激酶阻滞基因1B(CDKN1B)基因表达(P0.05),20~120 g·L-1健脾方也呈现量效抑制CDKN1B基因表达(P0.05);5~20 g·L-1肝癌全方明显抑制糖皮质激素调节蛋白激酶1(SGK1)基因表达(P0.05),且量效显著;5~20 g·L-1清热方量效抑制SGK1基因表达(P0.05);20~120 g·L-1健脾方也抑制SGK1基因表达(P0.05),同时肝癌全方及清热、活血治法方可抑制SGK1磷酸化蛋白的表达(P0.05);1.25,20 g·L-1肝癌全方可促进叉头框蛋白O3(FOXO3)基因表达(P0.05);15,20 g·L-1清热方明显促进FOXO3基因表达(P0.05);20 g·L-1活血方促进FOXO3基因表达(P0.05)。与空白组比较,全方组G2期细胞数增加(P0.05),清热组和健脾组G2期细胞数增加更明显(P0.05);肝癌全方及不同治法拆方能够抑制细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)蛋白的表达,其中以健脾组抑制效果最显著。结论:肝癌全方及其不同治法拆方通过改变细胞增殖和周期,从而发挥抑制肝癌的作用。     

何首乌醇提物对人正常肝细胞L02的毒性作用及其机制

目的:探究何首乌醇提物(PME)对人正常肝细胞L02的毒性损伤和作用机制,为何首乌合理安全用药提供依据。方法:以PME(5,10,20 g·L^-1)作用于L02细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性;Hoechst 33342染色法观察细胞核形态;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡率;相关试剂盒检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)释放率、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;JC-1法检测细胞线粒体膜电位(MMP)变化;流式细胞术检测活性氧(ROS)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前体(pro Caspase-9)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3前体(pro Caspase-3)的表达水平。结果:与空白组比较,L02细胞在PME作用下存活率下降,呈时间浓度依赖性;Hoechst 33342染色后荧光下可见细胞核皱缩,碎裂,染色质凝集;Annexin V-FITC/PI双染法结果表明PME20 g·L^-1组凋亡率上升;PME 20 g·L^-1组LDH释放率显著增加(P<0.01),细胞内ROS水平显著上升(P<0.01),SOD活力显著下降(P<0.01),PME 5,10,20 g·L^-1组MMP明显降低(P<0.05)。与空白组比较,随着PME给药组浓度增加,PME 10,20 g·L^-1组pro Caspase-3,pro Caspase-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),PME 5,10,20 g·L^-1组Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),PME 20 g·L^-1组Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:PME对L02细胞存在毒性损伤作用,可一定程度破坏肝细胞的结构,促进ROS水平升高,诱导氧化应激,激活线粒体途径,活化凋亡通路相关蛋白引起肝细胞损伤,提示ROS介导的线粒体通路参与了PME诱导肝细胞凋亡的过程。     

基于"异类相制"的雷公藤复方对小鼠精母细胞凋亡及凋亡蛋白表达的影响

目的:探讨雷公藤复方单体成分对小鼠精母细胞凋亡及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响。方法:建立体外培养小鼠精母细胞体系,实验分为空白组,雷公藤甲素3.5 mg·L~(-1)组,雷公藤甲素3.5 mg·L~(-1)+梓醇3 mg·L~(-1)组,雷公藤甲素3.5 mg·L~(-1)+三七总皂苷12 mg·L~(-1)组,雷公藤甲素3.5 mg·L~(-1)+草酸铵1.5 mg·L~(-1)组,雷公藤甲素3.5 mg·L~(-1)+青藤碱0.75 mg·L~(-1)组。流式细胞仪测定药物作用24 h后精母细胞凋亡率,Western blot测定精母细胞Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白表达情况。结果:梓醇、三七总皂苷可减轻雷公藤甲素对小鼠精母细胞凋亡的诱导作用,与雷公藤甲素比较有明显差异(P0.05),草酸铵和青藤碱组与雷公藤甲素组相比无明显差异;雷公藤甲素促使Bax,Caspase-3蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,与正常比较差异显著(P0.01),雷公藤甲素配伍梓醇、三七总皂苷后Bax,Caspase-3蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调,与雷公藤甲素比较较有明显差异(P0.05)。而配伍草酸铵及青藤碱则差异不明显。结论:雷公藤甲素可引起精母细胞凋亡,并通过Bax/Bcl-2,Caspase-3系统启动精母细胞凋亡。而雷公藤复方组成中其他药物组分可不同程度抑制雷公藤甲素引起的精母细胞凋亡,减轻其雄性生殖毒性。     

黄芩素对中波紫外线诱导角质形成细胞凋亡及相关细胞因子表达的影响

目的:研究黄芩素对中波紫外线(UVB)诱导角质形成细胞凋亡及相关细胞因子表达的影响。方法:体外培养人皮肤角质形成细胞(HaCaT),取对数生长期的细胞,随机分为空白组、模型组和黄芩素组,并用30 mJ·cm~(-2)的UVB照射模型组和黄芩素组,建立光老化模型。噻唑蓝(MTT)比色法筛选黄芩素的有效安全浓度,并测定黄芩素对光老化HaCaT细胞增殖率的影响;活性氧自由基(ROS)试剂盒测定各组细胞中ROS含量;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒测定各组细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定各组细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),半胱氨酸天冬氨酸-3(Caspase-3)及Caspase-9蛋白表达水平。结果:筛选出1×10~(-7),1×10~(-6),1×10~(-5)mol·L~(-1)黄芩素为最佳有效安全浓度。与空白组比较,模型组ROS含量和细胞凋亡率显著升高(P0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P0.01),Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平显著升高(P0.01)。与模型组比较,1×10~(-7),1×10~(-6),1×10~(-5)mol·L~(-1)黄芩素组ROS含量和细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P0.05,P0.01),Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平显著下降(P0.05,P0.01)。结论:黄芩素可以通过降低细胞ROS含量和凋亡率,调控Bcl-2家族中抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达,降低凋亡相关细胞因子Caspase-3和Caspase-9的表达水平,抑制UVB诱导的细胞凋亡。     

藜芦配伍人参对未成熟小鼠雌激素样作用的影响

目的:观察藜芦配伍人参对未成熟小鼠子宫系数、性激素水平、靶器官子宫和阴道的病理学变化的影响。方法:昆明种雌性小鼠120只,随机分为正常组、特异性雌激素受体拮抗剂ICI组(5 mg·kg-1)、藜芦组(0.045 g·kg-1)、人参低、中、高剂量组(12,18,24 g·kg-1)、ICI和人参低剂量混合组(混合低剂量组)、ICI和人参中剂量混合组(混合中剂量组)、ICI和人参高剂量混合组(混合高剂量组)、藜芦和人参低剂量配伍组(配伍低剂量组)、藜芦和人参中剂量配伍组(配伍中剂量组)、藜芦和人参高剂量配伍组(配伍高剂量组),每组10只,给药5 d后分别观察小鼠子宫系数,血清中雌二醇(E2),黄体生成素(LH),促卵泡生成素(FSH)的水平及子宫、阴道的病理学变化。结果:与正常组比较,人参各剂量组能使未成熟小鼠的子宫系数显著增加(P0.05),E2含量明显升高(P0.05,P0.01),LH,FSH的水平显著降低(P0.05,P0.01),还能明显促进靶器官子宫、阴道的生长发育。配伍藜芦后,人参各剂量组的子宫系数明显降低(P0.05,P0.01),血清E2,LH和FSH水平明显升高(P0.05,P0.01),子宫和阴道的促生长发育作用减弱。结论:藜芦与特定剂量的人参配伍能够妨害人参的雌激素样作用。     

益气活血方对糖尿病大鼠p38MAPK通路的影响

目的:观察益气活血方对糖尿病大鼠基于p38丝裂原活化的蛋白激酶(p38MAPK)信号通路对血管内皮功能受损的综合调节作用机制。方法:采用高脂高糖饮食和应用链脲佐菌素(STZ)建立大鼠糖尿病模型,将大鼠随机分成7组,分别为正常组,模型组,丹蛭降糖胶囊高、中、低剂量组(1.08,0.72,0.54 g·kg-1·d-1),盐酸吡格列酮胶囊组(10 mg·kg-1·d-1),丹蛭降糖胶囊+盐酸吡格列酮胶囊结合组(1.08 g·kg-1·d-1+10 mg·kg-1·d-1)。大鼠造模成功后分别按相应剂量药物ig给予,每日1次,连续8周,后腹主动脉采集血液样本和腹主动脉进行相关检测,蛋白质免疫印迹(Western blot)法测定p38MAPK,上游MAPK激酶3/6(mitogen activated protein kinase kinasse3/6,MKK3/6),下游核转录因子c AMP反应元件结合蛋白1(c AMP response element-bingding protein,CREB1)以及其丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)信号蛋白在内皮细胞的蛋白表达量;实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)方法测定单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),血管内皮细胞抵抗素在血管内皮中的mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组p38MAPK,MKK3/6,CREB1蛋白及MCP-1,血管内皮细胞抵抗素mRNA表达水平明显升高(P0.01),MKP-1蛋白表达水平明显降低(P0.01);各给药组p38MAPK,MKK3/6,CREB1蛋白及MCP-1,血管内皮细胞抵抗素mRNA表达水平均明显降低,MKP-1蛋白表达水平均明显升高,与模型组大鼠比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论:益气活血方通过调节糖尿病大鼠血管p38MAPK信号通路蛋白表达水平,从而达到降低血管内皮功能损伤的作用。     

银杏叶提取物对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的:观察银杏叶提取物对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞凋亡的影响并初步探讨可能机制。方法:体外培养ARPE-19细胞株,分为正常组(5.5 mmol·L-1葡萄糖),高糖组(30 mmol·L-1葡萄糖),银杏叶提取物组(30mmol·L-1葡萄糖+12.5,25,50,100 mg·L~(-1)银杏叶提取物)。噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性;流式细胞术测定细胞凋亡率;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)测定B细胞白血病/淋巴瘤相关抗原-2(Bcl-2),白血病/淋巴瘤相关抗原相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),凋亡相关因子(Fas),Fas受体(Fas L)mRNA和蛋白的表达。Western blot检测c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化及核JNK表达变化。结果:高糖组吸光度A明显低于正常组(P0.05),12.5,25,50,100 mg·L~(-1)银杏叶提取物组比高糖组A明显升高(P0.05);高糖组细胞凋亡率明显高于正常组,12.5,25,50,100 mg·L~(-1)银杏叶提取物组比高糖组细胞凋亡率明显降低(P0.05);与正常组比较,高糖组Bax和Caspase-3,Fas和Fas L表达升高(P0.05),12.5,25,50,100 mg·L~(-1)银杏叶提取物组能降低Bax和Caspase-3的表达,升高Bcl-2表达水平,降低Fas和Fas L表达(P0.05);与正常组比较,高糖组JNK磷酸化及核JNK蛋白水平升高(P0.05),12.5,25,50,100 mg·L~(-1)银杏叶提取物降低JNK磷酸化及核JNK表达(P0.05)。结论:银杏叶提取物能通过JNK通路,抑制细胞凋亡,改善糖尿病视网膜病变。