氢化可的松诱发虚证模型小鼠的证候特征再评价及肾上腺皮质功能变化研究

目的研究氢化可的松诱发虚证模型小鼠的证候特征及其可能的物质基础。方法将60只雄性昆明种小鼠随机分为正常对照组和模型组,每组30只。正常对照组自由饮水与摄食,模型组自由饮用剂量递减的氢化可的松溶液。其中,0.015 g·kg~(-1)·d~(-1)剂量,饮用3天;0.010 g·kg~(-1)·d~(-1)剂量,饮用5天;0.007 5 g·kg~(-1)·d~(-1)剂量,饮用7天。在造模的第8天、第15天,采用本课题组建立的小鼠四诊标准采集技术与辨证方法判断小鼠的证候属性;于造模的第3天、第8天、第15天分批处死小鼠,取肾上腺组织,分别抽提RNA和蛋白质,以实时荧光定量PCR技术检测相关基因表达,以Western blotting法检测类固醇合成急性调节蛋白(STAR)表达,并以ELISA方法检测血清促肾上腺皮质激素(ACTH)含量。结果 ?与正常对照组比较,模型组小鼠在造模期间,消瘦、体质量增长显著减慢(P0.05),被毛蓬松易脱落、光泽度下降,活动度降低、喜蜷缩,体温尤其是尾部温度下降,爪部色泽变化不明显。②造模第15天,与正常对照组比较,模型组小鼠气虚证、阴虚证明显,肾上腺、脾脏与胸腺持续性萎缩(P0.05);血液ACTH水平下降(P0.05);肾上腺皮质激素合成过程重要受体Srb1、Ldlr基因表达降低(P0.01),类固醇激素合成酶Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2基因表达及其酶的调节因子Fdx1、Fdxr、Nr4a1、Nr4a2、Nr5a1基因表达显著下降(P0.05),以及STAR蛋白表达水平明显降低(P0.01)。结论氢化可的松复制的小鼠模型属于虚证模型,具有气虚与阴虚证的特征;参与肾上腺皮质激素合成的重要功能分子涉及相关证候的发生。     

经典气血阴阳虚证模型小鼠在“肾藏象”层面的证候物质基础研究

目的研究气血阴阳虚证模型小鼠在"肾藏象"层面的证候物质基础。方法以雄性ICR小鼠为对象,以控食法复制气虚证模型,以乙酰苯肼复制血虚证模型,以甲状腺素复制阴虚证模型,以氢化可的松复制阳虚证模型。动态观察小鼠体质量变化,检测各脏器变化;取肾脏、肾上腺和骨髓组织抽提RNA,以实时荧光定量PCR技术检测相关基因表达;以ELISA方法检测血清皮质酮含量。结果 (1)与正常对照组比较,控食组小鼠体质量下降最显著(P0.01),乙酰苯肼和氢化可的松组小鼠体质量也显著下降(P0.05);控食组和氢化可的松组小鼠脾脏与胸腺明显萎缩(P0.01),乙酰苯肼组小鼠脾脏显著肿大、而胸腺严重萎缩(P0.01)。(2)与正常对照组比较,控食组和乙酰苯肼组血清皮质酮水平显著升高(P0.05),而氢化可的松组显著下降(P0.001)。(3)控食组小鼠肾上腺合成皮质激素的重要酶Star、Cyp21a1、Cyp11b1表达显著升高(P0.05);肾脏Epo表达显著升高(P0.05),Csf2显著下降(P0.05);骨髓Tpo、IL-4表达显著上调(P0.05)。(4)乙酰苯肼组小鼠肾上腺Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1表达显著升高(P0.05);肾脏Epo、Csf2、Csf3表达显著升高(P0.05);骨髓Csf3、IL-4、IL-5、IL-6表达显著升高,而IL-1b和IL-7显著下降(P0.05)。(5)甲状腺素组小鼠肾上腺Cyp11b1表达显著升高(P0.05);肾脏Epo表达显著升高,Csf2显著下降(P0.05);骨髓Csf3、IL-2和IL-5表达显著下降(P0.05)。(6)氢化可的松组小鼠Star、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2表达显著下降(P0.05),肾脏Epo表达显著升高,而Csf1和Csf2显著下降(P0.05),骨髓Csf3、IL-1b、IL-5和IL-7表达显著下降,IL-4却显著升高(P0.05)。结论通过控制摄食量,给予乙酰苯肼、甲状腺素及氢化可的松,可以复制出相关的中医虚证模型,且在肾上腺、肾脏及骨髓等"肾藏象"层面存在相应的物质功能变化。     

均匀设计优选小檗碱、大黄素、桂皮醛抗肝癌最佳配伍的体内研究

目的均匀设计优选小檗碱、大黄素、桂皮醛抗肝癌的最佳组分配伍。方法右腋下皮下注射人肝癌细胞建立裸鼠肝癌移植瘤模型,采用均匀设计表U_6(6~4)就小檗碱、大黄素、桂皮醛进行"3因子6水平"的分组设计给药,给药2周,其间观察小鼠的状态和死亡情况、体质量、瘤体积变化,处死小鼠后取瘤体称重,计算抑瘤率,并常规制作肿瘤组织病理切片。以抑瘤率作为主要筛选指标,并经均匀设计回归分析获得三者的最佳配伍方式。结果 (1)各组小鼠状态无异常,无死亡情况。(2)各用药组小鼠体质量有降低趋势。(3)与模型组比较,各用药组的瘤体积及瘤重均有降低趋势,即均具有不同程度的抑瘤作用,其中以配伍4组作用为甚,其抑瘤率约为23%。(4)病理切片显示肿瘤的特征性组织形态,含细胞大小、形态、核浆比、核型及细胞间质变化,其中以配伍4组的形态变化优于其他各组。(5)筛选获得回归方程Y=1.95+1.302A-0.253B+0.290C,即当小檗碱(A)和桂皮醛(C)分别取最大值10μg/g和50μg/g,大黄素(B)取最小值25μg/g时,三者配伍能达到最佳的抑瘤效果。结论小檗碱、大黄素、桂皮醛三者配伍能有效抑制肝癌组织的生长,其最佳配伍比例为2∶5∶10。     

肝癌全方及其不同治法拆方抑制SMMC7721人肝癌细胞增殖的作用

目的:探讨肝癌全方及不同治法拆方抗肿瘤作用的分子机制。方法:体外培养SMMC7721人肝癌细胞,分别给予2.5~100 g·L-1肝癌全方、清热方、活血方、健脾方干预24 h后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖;分别采用1.25~20 g·L-1肝癌全方,5~20 g·L-1清热方和活血方及20~120 g·L-1健脾方干预24 h后,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测相关基因的表达;分别采用20 g·L-1肝癌全方和清热方,10 g·L-1活血方及120 g·L-1健脾方干预SMMC7721细胞24 h后,通过蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达,通过碘化丙啶(PI)/RNase staining solution试剂染色检测细胞周期的改变。结果:与空白组比较,肝癌全方及其不同治法拆方能抑制SMMC7721细胞的增殖,并呈现量效关系(P0.05)。与空白组比较,5~20 g·L-1清热方呈现量效抑制细胞周期依赖性激酶阻滞基因1B(CDKN1B)基因表达(P0.05),20~120 g·L-1健脾方也呈现量效抑制CDKN1B基因表达(P0.05);5~20 g·L-1肝癌全方明显抑制糖皮质激素调节蛋白激酶1(SGK1)基因表达(P0.05),且量效显著;5~20 g·L-1清热方量效抑制SGK1基因表达(P0.05);20~120 g·L-1健脾方也抑制SGK1基因表达(P0.05),同时肝癌全方及清热、活血治法方可抑制SGK1磷酸化蛋白的表达(P0.05);1.25,20 g·L-1肝癌全方可促进叉头框蛋白O3(FOXO3)基因表达(P0.05);15,20 g·L-1清热方明显促进FOXO3基因表达(P0.05);20 g·L-1活血方促进FOXO3基因表达(P0.05)。与空白组比较,全方组G2期细胞数增加(P0.05),清热组和健脾组G2期细胞数增加更明显(P0.05);肝癌全方及不同治法拆方能够抑制细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)蛋白的表达,其中以健脾组抑制效果最显著。结论:肝癌全方及其不同治法拆方通过改变细胞增殖和周期,从而发挥抑制肝癌的作用。     

不同温补肾阳中药主要组分对小鼠肾上腺皮质瘤细胞增殖及皮质酮分泌的影响

目的:研究温补肾阳中药主要组分对小鼠肾上腺皮质瘤细胞增殖及皮质酮分泌的影响。方法:以Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象,分别采用0.2~640μmol/L淫羊藿苷、仙茅苷、金丝桃苷、松果菊苷、松脂醇二葡萄糖苷、补骨脂素和耐斯糖干预Y1细胞24~72 h;并以0.1%DMSO为对照组,佛司可林为诱导剂组;通过MTT法检测细胞增殖、q PCR检测细胞皮质酮合成酶基因表达、ELISA检测细胞上清液皮质酮水平。结果:Y1细胞铺板0~72 h内,对照组细胞增殖明显,80~640μmol/L淫羊藿苷治疗72 h显著抑制Y1细胞增殖,且呈现量效关系(P0.05);640μmol/L松果菊苷治疗24 h、48 h和72 h均显著抑制Y1细胞增殖(P0.05);10~80μmol/L补骨脂素治疗48 h显著促进Y1细胞增殖(P0.05);大于320μmol/L补骨脂素治疗72 h显著抑制Y1细胞增殖(P0.05);然而,仙茅苷、金丝桃苷、松脂醇二葡萄糖苷、耐斯糖对Y1细胞增殖无明显影响。基础状态下,与对照组比较,仅10μmol/L补骨脂素显著增强Cyp11b1基因表达(P0.05);佛司可林显著促进各组Star、Cyp11a1和Cyp11b1基因表达及皮质酮分泌(P0.05)。结论:淫羊藿苷、松果菊苷和补骨脂素对Y1细胞增殖抑制作用与其浓度和作用时间有关,本研究中采用的温补肾阳中药主要组分对Y1细胞皮质酮合成与分泌作用弱。     

结核分枝杆菌感染对巨噬细胞糖酵解的影响和机制研究

目的分析结核分枝杆菌感染对巨噬细胞糖酵解的影响和潜在机制。方法建立人型结核分枝杆菌H37Rv感染人巨噬细胞系U937细胞的体外模型,分别于感染后0、30、60和90 min检测乳酸生成情况。根据不同处理方法将巨噬细胞U937分为感染组(结核分枝杆菌H37Rv感染60 min)、感染+SB203580[p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂]组、感染+小干扰RNA(siRNA)阴性对照组、感染+siRNA-6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)组和空白对照组。采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫印迹法检测各组细胞中PFKFB3。磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)的表达及肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、乳酸的生成情况。结果结核分枝杆菌可诱导巨噬细胞中PFKFB3的表达,增加乳酸的生成量,感染60 min后乳酸水平达到最大值;给予SB203580干预,可抑制感染后p-p38 MAPK和PFKFB3的表达。沉默巨噬细胞内源性PFKFB3的表达可明显拮抗结核分枝杆菌感染诱导的巨噬细胞炎性因子增加和糖酵解增强。结论结核分枝杆菌感染巨噬细胞后,可通过p38 MAPK信号通路的活化上调PFKFB3的表达,并促进巨噬细胞糖酵解和炎性因子分泌。     

对Walker256荷瘤大鼠实施实体瘤中心变性粉碎引流术的可行性评价

目的:评价实体瘤中心变性粉碎引流术(the method of solid tumors center’s denaturation,smashing and drainage,TCDSD)的疗效及安全性。方法:采用腹水型Walker 256乳腺癌细胞接种雄性SD大鼠腋下形成实体瘤模型,分别设模型对照组(A组)、实体瘤中心热变性组(B组)、热变性+中心粉碎+引流(TCDSD)组(C组)、TCDSD后粉碎腔内阿霉素和预知子种子醇提物复合给药组(D组)。分别予相应干预,并分析各组大鼠肿瘤生长及肿瘤空腔重构情况,比较大鼠荷瘤体质量及对肝、肾、脾的影响。结果:瘤质量见C组D组B组A组的趋势;抑瘤率见C组D组B组的趋势;C、D组大鼠肿瘤粉碎腔均被肿瘤及变性后肿瘤组织填满,实现术区重构;各组大鼠荷瘤体质量、去瘤体质量、肝肾脾质量差异均无统计学意义(P0.05),肝肾脾外观无明显差别,提示各治疗组均未见毒副作用。结论:TCDSD治疗实体瘤安全有效,是对完善和优化现有肿瘤治疗方案的积极探索。     

佛司可林对小鼠睾丸间质细胞雄激素合成酶及调节分子的影响

目的:研究佛司可林(FSK)对小鼠睾丸间质细胞雄激素合成的影响。方法:以TM3小鼠睾丸间质细胞为实验对象,分别采用1μmol/L、10μmol/L FSK处理TM3细胞15 min~24 h等不同时间,运用ELISA方法检测细胞分泌液睾酮含量,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法检测细胞的雄激素合成相关基因mRNA表达。结果:与对照组比较,1μmol/L FSK处理24 h后对睾酮分泌无明显影响(P0.05),但FSK可显著增强TM3细胞类固醇急性调节蛋白(Star)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)基因表达上调(P0.01);对17α羟化酶(Cyp17a1)、3β羟基类固醇脱氢酶(Hsd3b2)和黄体生成素受体(Lhr)基因表达无明显作用(P0.05)。与对照组比较,采用10μmol/L FSK干预TM3细胞15 min~12 h,干预1 h起即可显著增强Star基因表达上调20倍以上(P0.01);干预4 h起显著促进Cyp11a1基因表达上调4倍以上(P0.05,P0.01);FSK作用15 min起即可上调核受体Nr4a1基因表达(P0.05),作用1 h时可显著增强Nr4a1基因表达上调达80倍(P0.01);FSK干预1 h后可显著促进核受体Nr4a2基因表达上调达100倍以上(P0.01);FSK作用8 h后才明显上调核受体Nr5a1基因表达(P0.05)。结论:FSK能促进TM3小鼠睾丸间质细胞雄激素合成起始环节限速酶与即刻早期转录因子核受体基因转录,有助于雄激素合成前体物质孕烯醇酮以增加储备。     

糖皮质激素诱发小鼠药源性证候模型规范化研究及其评价标准

目的:对糖皮质激素诱发的小鼠药源性证候模型建立规范化的造模方法及评价标准。方法:对模型动物、糖皮质激素类药物及其干预的剂量、时间等进行考察,采用小鼠辨证论治实验方法学以及反映肾上腺皮质功能的实验指标综合评价小鼠证候属性。结果:对糖皮质激素诱发的小鼠药源性证候模型,建议首选ICR小鼠,常规造模采用3.3 g·kg~(-1)·d~(-1)氢化可的松连续灌胃14 d;大剂量短期造模采用25 g·kg~(-1)·d~(-1)氢化可的松连续灌胃5 d;小剂量长期造模采用0.33 g·kg~(-1)·d~(-1)氢化可的松连续灌胃28 d;小剂量减停干预造模采用0.66 g·kg~(-1)·d~(-1)氢化可的松连续灌胃给药28 d、再剂量减半7 d、停药14 d。较理想的评价指标包括:体质量、脾脏指数、胸腺指数、腋温、体表红外温度、自主行为活跃度、四肢抓力、血液皮质酮、肾上腺类固醇激素合成酶特异性分子(StAR、CYP11A1、CYP11B1、CYP21A1、SRBI、LDLR)、肾上腺皮质形态及超微结构。结论:对糖皮质激素诱发的小鼠药源性证候模型建立了规范化的造模方法及可量化的疗效评价标准,为中药及其复方的药效研究提供理想的小鼠证候模型。     

蛇床子素对Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质功能的影响

目的研究蛇床子素(Osthole,Ost)对肾上腺皮质功能的影响。方法以Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞为实验对象,以含10%、1%和0.1%血清培养液培养细胞,分别采用1、10、25、50、100、200μmol/L Ost处理Y1细胞24、48 h,以0.1%二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照组,腺苷酸环化酶激活剂(Bu)2cAMP为阳性对照组,倒置显微镜下观察细胞形态变化,采用ELISA法检测细胞分泌液皮质酮含量,RT-qPCR法检测类固醇急性调节蛋白(Star)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)、21α-羟化酶(Cyp21a1)、3β-羟基类固醇脱氢酶(Hsd3b2)、11β-羟化酶1(Cyp11b1)、11β-羟化酶2(Cyp11b2)、17α-羟化酶/17,20-碳链裂解酶(Cyp17a1)及17β-羟基类固醇脱氢酶3(Hsd17b3)基因表达水平。结果 100、200μmol/L Ost组可明显抑制Y1细胞增殖,且对含0.1%血清培养液中细胞抑制作用更明显。与阴性对照组比较,阳性对照组Y1细胞Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Hsd3b2、Cyp11b1、Cyp17a1及Hsd17b3基因表达水平明显增强(P0.05);干预24、48 h,50μmol/L Ost组Y1细胞皮质酮水平明显升高(P0.05)。与24 h比较,干预48 h后,25、50μmol/L Ost组皮质酮含量明显升高(P0.01)。干预24 h后,25、50μmol/L Ost组Star、Cyp21a1、Hsd3b2基因表达明显增强(P0.05);干预48 h后,Star基因表达水平进一步增强(P0.05),但Cyp11a1基因表达无明显差异(P0.05)。干预24、48 h后,10、25、50μmol/L Ost组皮质酮合成酶Cyp11b1和性激素合成酶Cyp17a1基因表达明显增强(P0.05);Ost对醛固酮合成酶Cyp11b2和性激素合成酶Hsd17b3基因表达水平未见明显作用。结论蛇床子素通过增强类固醇激素合成相关酶基因表达,参与调节肾上腺皮质功能,并以促进皮质酮的合成与分泌作用为主。