尿多酸肽诱导慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药细胞生长抑制及分化的体外观察

目的观察尿多酸肽（CDA-2）在体外对慢性粒细胞性白血病（CML）伊马替尼（IM）耐药细胞株K562R生长抑制及诱导分化的作用。方法MTT和集落形成实验观察CDA-2对CML细胞株K562、IM耐药细胞株K562R、IM耐药和非耐药CML患者骨髓细胞生长抑制作用。吉姆萨染色观察细胞形态,膜联蛋白-V（Annexin-V）／碘化丙啶（PI）染色分析细胞凋亡,流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b、CD14的表达,反转录PCR（RT-PCR）检测细胞分化相关基因、细胞周期调节基因及DNA甲基化转移酶基因的表达。结果CDA-2均可抑制K562、K562R、IM耐药和非耐药CML患者骨髓细胞的生长,且对K562R细胞和IM耐药CML患者骨髓细胞的生长抑制更明显;CDA-2改变了K562和K562R细胞形态,诱导细胞向成熟分化,并引起细胞周期在G1期的停滞;这种停滞可能与CDA-2抑制DNA甲基转移酶活性,逆转细胞周期调节基因的甲基化状态有关。结论CDA-2在体外对K562R细胞株有很强的生长抑制和诱导分化的作用,提示CDA-2可能成为治疗IM耐药的CML患者的一种新药。     

小分子酪氨酸激酶抑制剂AG-490对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞增殖凋亡的影响

目的探讨酪氨酸激酶抑制剂AG-490对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞的增殖及凋亡的影响。方法采用MTT法观察AG-490在体外对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞增殖的影响,光学显微镜下观察AG-490对K562细胞形态的变化,流式细胞术检测AG-490对K562细胞凋亡及细胞周期的影响,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR技术检测AG-490作用后K562细胞bcr/abl融合基因及凋亡相关基因c-myc mRNA的表达水平。结果 AG-490可明显抑制K562细胞的增殖,并随药物作用时间的延长和浓度的增加,抑制作用越明显（P〈0.05）;AG-490可使细胞周期阻滞于G1期,促使其凋亡（P〈0.05）。AG-490作用于K562细胞48 h后bcr/abl融合基因的表达无明显改变（P〉0.05）,而c-myc的表达水平明显降低（P〈0.05）。结论 AG-490可能通过阻断JAK2信号通路而下调c-myc的表达,使K562细胞阻滞于G1期,从而抑制K562细胞增殖,促使其凋亡。     

三七总皂苷对K562细胞增殖、凋亡及周期的影响及机制

目的研究三七总皂苷（PNS）对K562 细胞增殖、凋亡、周期的影响及其相关分子机制。方法采用MTT法检测PNS对
K562细胞增殖的影响;AO/EB双荧光染色法及Annexin V-FITC/PI双染色法观察细胞凋亡及死亡状况;流式细胞术检测K562
细胞的周期变化;RT-PCR检测mTOR信号通路主要分子mRNA的表达变化;Western blot 检测cleaved caspase-3 蛋白、cyclin
D1蛋白及mTOR信号通路主要蛋白及磷酸化蛋白的表达量变化。结果100~800 μg/mL的PNS 作用于K562细胞后能够抑制
细胞增殖。PNS能够上调cleaved caspase-3蛋白表达,促使K562细胞发生凋亡。并且下调cyclin D1蛋白表达,促使K562细胞
阻滞在G0/G1期。同时,PNS 能够抑制K562 细胞mTOR mRNA 表达,降低mTOR 蛋白和磷酸化蛋白p-mTOR（Ser2448）、
p-p70S6K（Thr229/389）及p-4E-BP1（Thr37/46）的表达,从而抑制mTOR信号通路活性。结论PNS 对体外培养K562细胞有抑
制增殖,促进凋亡,使其发生周期阻滞的作用。其机制可能与PNS抑制mTOR信号通路活性、上调cleaved caspase-3蛋白表达
及抑制cyclin D1蛋白表达有关。
     

人参多糖对K562细胞凋亡与细胞周期的影响及其机制

目的探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)诱导白血病细胞K562凋亡和周期阻滞的机制。方法取对数生长期的K562细胞,调整密度为7×108/L,空白对照组予以常规培养;GPS组加入400 mg/L GPS。流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布变化;RT-PCR检测细胞ERK表达的变化。免疫组化的方法检测细胞中p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白定位及表达量的变化。Western blot检测细胞中ERK、p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白的变化。结果与对照组比较,K562细胞在400 mg/L GPS的作用下,体外培养24、48、72 h后,GPS组细胞凋亡率显著增高(P<0.05),周期分布检测结果显示,与对照组相比,GPS组K562细胞G0/G1期细胞数量呈时间依赖性增多(P<0.05),G2+M、S期细胞数量则明显减少(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,400 mg/L GPS处理48 h组ERK mRNA的表达水平明显低于对照组(0.20vs 0.50,P<0.05)。免疫组化显示p-ERK、NF-κB、Cyclin D1主要分布在细胞核和细胞质,与对照组相比,GPS组K562细胞内p-ERK、NF-κB、Cyclin D1的表达明显减弱。Western blot检测结果显示,ERK总蛋白无明显变化(P>0.05),而p-ERK、NF-κB、Cyclin D1随时间变化有减少趋势,且在48 h减少明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论人参多糖GPS可促使K562细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导K562细胞凋亡,且均呈时间依赖性。GPS促进K562细胞凋亡、导致其细胞周期阻滞的机制可能是通过抑制ERK/NF-κB信号通路的激活,进而下调Cyclin D1来实现的。     

格列卫与六亚甲基二乙酰胺对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究格列卫和六亚甲基二乙酰胺(HMBA)对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期及周期蛋白表达的影响．方法：MTT法观察细胞生长指数和细胞存活率，流式细胞仪、电镜检测细胞周期和凋亡，半定量RT-PCR检测bcr-abl基因的表达，Western blotting检测蛋白表达．结果：联合应用两种药物后细胞存活率明显下降，凋亡比例略下降，细胞周期阻滞于G0／G1期，cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK4、c-myc蛋白表达下调．结论：两种药物应用后出现细胞存活率下降、细胞周期阻滞、周期蛋白表达下调、凋亡比例下降，联合作用对细胞的增殖抑制具有协同作用，进入凋亡途径细胞减少。     

环孢素A对体外人系膜细胞cyclin E,cyclin D1,p27kip1蛋白表达的影响

目的探讨环孢素A(CsA)对人系膜细胞增殖的抑制作用及细胞周期蛋白D1、E、p27kip1表达影响。方法人系膜细胞常规体外培养,分为实验组和对照组,实验组加入不同浓度的CsA(0.1,1,5μmol/L)干预。药物作用24,48,72 h后MTT比色法测定细胞增殖情况。药物作用48 h后采用流式细胞仪检测细胞周期。药物作用48 h后Western blot法检测细胞中cyc-lin D1、cyclin E、p27kip1蛋白质表达情况。结果 CsA对人系膜细胞具有时间、浓度依赖性抑制作用;且浓度依赖性阻滞细胞周期,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少(P<0.05)。CsA浓度依赖性下调cyclin D1、cyclin E蛋白,上调p27kip1蛋白的表达(P<0.05)。结论 CsA通过下调cyclin D1、cyclin E蛋白,上调p27kip1蛋白的表达,调节细胞周期调控通路,阻滞细胞于G0/G1期,有效抑制人系膜细胞的增殖。     

三丁酸甘油酯对K562 白血病细胞的体外作用

目的观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂三丁酸甘油酯(tributyrin，TB)对K562白血病细胞增殖、凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。方法用细胞计数及台盼兰拒染法观察TB对K562细胞增殖及活力的影响，通过细胞形态观察、流式细胞术分析观察TB对K562细胞体外诱导凋亡的情况，RT—PCR技术分析p2l^WAFl表达的改变。结果(1)TB抑制：K562细胞的增殖。(2)TB诱导K562白血病细胞的凋亡，影响细胞周期的进程，使细胞周期阻滞于G2／M期。(3)在TB引起的K562细胞增殖抑制及凋亡过程中，p2l^WAFl表达增加。结论TB抑制K562白血病细胞的增殖并诱导凋亡，阻滞细胞周期进程于G2／M期，p2l^WAFl在此过程中发挥作用。     

全反式维甲酸诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达的研究

目的 研究K562白血病细胞在全反式维甲酸(ATRA)诱导分化过程中线粒体铁蛋白(MtF)、运铁蛋白受体1(TfR1)和铁蛋白(Fn)mRNA表达水平的变化情况,探讨MtF在白血病细胞增殖和铁代谢方面的作用.方法 K562细胞加入ATRA(终浓度1 μmol/L)中诱导培养,分别于第1、3、5 d收集细胞,分别进行:①瑞士染色观察各时间点的细胞形态;流式细胞学检测细胞表面分化抗原CD13的表达;②Trizol法提取各时间点细胞的RNA,通过半定量RT-PCR方法 检测各时点MtF、TfR1和Fn基因的表达水平.同时设未用ATRA诱导培养的K562细胞为对照组.结果 1 μmol/L的ATRA可诱导K562细胞向粒系细胞分化,诱导培养第5 d,细胞表面CD13的表达水平增加,诱导分化率为21.2%,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).诱导分化前K562细胞即有MtF mRNA表达,但随细胞诱导时间的延长,MtF和TfR1 mRNA表达呈下降趋势,诱导分化第5 d的表达水平分别为诱导分化前的86.5%和79.2%;而Fn mRNA的表达呈上调趋势,诱导分化第5 d表达水平为诱导分化前的1.21倍.结论 ATRA诱导K562细胞向粒系细胞分化过程中,MtF和TfR1 mRNA表达下调,而Fn mRNA表达上调,这种协调变化有助于降低细胞通过TfR1介导的铁摄取,从而抑制或影响细胞增殖潜能.     

外源性IL-18基因对C6胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的:研究IL-18基因转染对C6胶质瘤细胞增殖活性及相关基因表达的影响. 方法:用流式细胞仪观察C6/IL-18细胞周期、增殖指数的变化;用RT-PCR,蛋白印迹、免疫细胞化学方法分析C6/IL-18细胞cyclin D1,cyclin B1,Bcl-2 mRNA及蛋白的表达. 结果:与亲代C6细胞相比,C6/IL-18细胞表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,细胞增殖指数(PI)降低. C6/IL-18细胞的cyclin D1和cyclin B1,Bcl-2 mRNA及蛋白表达降低. 结论: 外源性IL-18基因可降低C6细胞的增殖活性,其机制可能与Bcl-2,cyclin B1和cyclin D1表达下调有关.     

丁酸钠诱导K562细胞肺耐药相关蛋白表达的初步研究

目的；研究丁酸钠（NaB)对K562细胞肺耐药相关蛋白（LRP）表达的诱导作用，方法：以K562细胞为体外模型，采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测NaB诱导前后K562细胞LRP mRNA的水平，采用流式细胞仪检测比较NaB诱导前后K562细胞LRP蛋白表达的变化。结果：2mmol/L诱导后LRP mRNA水平，蛋白表达均明显增加，结论：NaB诱导可使K562细胞LRP mRNA水平和蛋白质表达的增加。     

Cigarette smoke extract promotes human pulmonary artery smooth muscle cells proliferation through protein kinase C alpha-dependent induction of cyclin D1

Background Exposure to cigarette smoke stimulates the proliferation of human pulmonary artery smooth muscle cells （HPASMCs） in vivo and in vitro. However, the molecular mechanism remains unclear. This study aimed at investigating the role of signaling pathways involving protein kinase C alpha （PKCα） and cyclin D1 in the cigarette smoke extract （CSE）-induced HPASMCs proliferation.Methods Synchronized HPASMCs were treated with different concentrations of CSE. Cell proliferation was evaluated by 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyttetrazolium bromide （MTT） assay and cell counting. Cell cycle was analyzed by flow cytometry with propidium iodide staining. Activation of PKCα was measured by detecting the expression of PKCαprotein in the cytosolic and membrane fractions using Western blotting analysis. Small interfering RNA （siRNA） was used to knockdown PKCα and cyclin D1. The cyclin D1 mRNA was assessed by real-time RT-PCR. The PKCα and cyclin D1protein levels were detected by Western blotting.Results Low concentrations of CSE （1%-10%） stimulated proliferation of HPASMCs, with its maximal effect at 5%.CSE （5%） led to PKCα activation. Inhibition of PKCα activity using G（o） 6976 or siRNA-mediated knockdown of PKCα significantly attenuated CSE-induced cell proliferation and G1/S transition. Cyclin D1, one of key regulators of G1/S transition, was found to be upregulated by 5% CSE at both the mRNA and protein levels. CSE-stimulated cellproliferation and G1/S transition was abolished by cyclin D1 siRNA. Moreover, G（o） 6976 or PKCα siRNA significantlysuppressed CSE-induced upregulation of cyclin D1 at both the mRNA and protein levels.Conclusion PKCα-cyclin D1 pathway at least partially mediates the CSE-induced proliferation in HPASMCs.     

海生素对K562/ADM抑制作用及其机理的初步研究

目的探讨海生素对K562/ADM细胞的抑制作用及其对凋亡相关蛋白bcl-2、bax表达的影响。方法采用MTT法测定海生素对K562/ADM细胞的体外抑制作用,免疫细胞化学法检测bcl-2、bax蛋白的表达。结果海生素对K562/ADM细胞有抑制作用,可下调bcl-2蛋白表达,上调bax蛋白表达。结论海生素在体外能明显抑制K562/ADM细胞生长,并影响bcl-2、bax蛋白的表达。     

Induction of myelogenous leukemia cells with histone deacetylase inhibitors through down-regulating the Daxx protein expression

The effects of two different histone deacetylase （HDAC） inhibitors, sodium butyrate （NAB） and trichostatin A （TSA）,on apoptosis of human leukemic cells in vitro and the molecular mechanisms were investigated. The experiments were divided up 5 groups： control group, NaB group, TSA group, NaB＋Z-VAD-FMK group and TSA＋Z-VAD-FMK group. The apoptosis rate was determined by mor- phological analysis and flow cytomytry. The expression of Daxx, Bcl-2, and Bcl-xl proteins was detected by Western blot. NaB and TSA could induce the apoptosis of HL-60 and K562 cells, and Z-VAD-FMK caused a marked decrease in apoptosis induced by HDAC inhibitors. HDAC inhibitors could down-regulate the expression of Daxx protein, but had no significant influence on the expression of Bcl-2 and Bcl-xl proteins. The results suggested that NaB and TSA induce distinct caspase-dependent apoptosis of human leukemic cells through down-regulating the expression of Daxx protein in vitro.     

三氧化二砷对A549细胞周期及cyclin D_1基因表达的影响

目的：研究三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）对肺腺癌A549细胞株细胞增殖、细胞周期以及cylin D1基因表达情况,初步探讨As2O3对肺腺癌细胞增殖的影响及其机制。方法：分别以不同浓度的As2O3作用于A549细胞,作用不同时间后,对细胞增殖活性、细胞周期及cylin D1基因表达的情况进行检测。结果：稍高浓度（〉2μmol/L）的As2O3可抑制A549细胞增殖,并有剂量和时间依赖性,As2O3可抑制A549细胞由G1期进入S期。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测cylin D1基因转录水平和细胞爬片免疫组化检测cyclin D1基因蛋白表达的相对强度,发现As2O3作用组cyclin D1基因表达与对照组相比明显减低（P〈0.01）。结论：As2O3可有效抑制A549细胞增殖,抑制效应呈量效和时效关系,并且能阻碍细胞周期由G1进入S期,这一过程可能与As2O3抑制cyclin D1基因表达有关。     

叶黄素对人食管鳞癌细胞诱导分化效应与机制探讨

目的 探讨叶黄素对食管癌EC9706 细胞诱导分化的影响及其机制.方法 食管癌EC9706细胞采用开放式单层贴壁培养.实验设溶剂对照及叶黄素3个剂量组,采用MTT法及流式细胞术,对EC9706 细胞的增殖和细胞周期进行分析,HE染色对细胞的形态学进行观察,酸解DNA甲绿-派洛宁技术了解增殖与分化型细胞比例,免疫组化检测cyclin D1的表达.结果 与溶剂对照组比较,叶黄素(100 μg/mL和150 μg/mL)可明显抑制EC9706 细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期, 降低细胞增殖指数,细胞形态趋向良性分化,cyclin D1 表达水平降低.结论 叶黄素可通过抑制cyclin D1 表达而介导食管癌EC9706细胞增殖抑制和诱导成熟分化.     

高三尖杉酯碱诱导K562和CML细胞凋亡及分化的实验研究

目的 明确三尖杉酯碱（HHT）治疗慢性粒细胞性白血病（CML）的机理。方法 应用细胞长曲线、克隆形成能力、细胞内血红蛋白含量测定、细胞形态,结合DNA凝胶电泳、流式细胞仪等方法,观察HHT对K562细胞株及CML慢性期细胞的作用方式。进一步用RT－PCR方法研究bcr-abl、c-myc 、max基因在转录水平的改变。结果 低浓度HHT抑制K562细胞的克隆形成能力并使K562细胞内血红蛋白含量增加;0.1umol /L 及以上浓度HHT可诱导K562细胞及CML细胞凋亡;细胞周期分析发现细胞阻滞于G1期。c-myc基因在加药24h开始下凋; bcr-abl和max基基的表达未见明显改变。结论 低浓度HHT可抑制K562 细胞增殖并诱导其向红系分化;超过一定“ 阈浓度”HHT可诱导K562细胞和CML慢性期细胞凋亡;HHT可通过抑制c-myc/max 表达来阻 滞细胞周期。     

Bcr/abl融合基因的小干扰RNA对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察特异性bcr/abl融合基因的siRNA对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法　设计并化学合成bcr/abl融合基因融合位点b3:a2 21个核苷酸 siRNA作用于K562细胞，用WST-8法检测细胞增殖抑制率；RT-PCR 检测 bcr/abl mRNA表达水平；PI单染流式细胞仪检测细胞周期；Annexin V-PI双染测定细胞凋亡比例；Hochest33258 染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果 ①Bcr/abl siRNA作用K562细胞24h,48h,72h后，明显抑制K562细胞增殖，各浓度组间的增殖抑制率无明显差异(p>0.05)；②Bcr/abl siRNA能显着下调bcr/abl mRNA水平，各浓度组间差异无显著性(p>0.05)；③Bcr/abl siRNA作用组细胞周期阻滞于G1期；④Bcr/abl siRNA作用后细胞出现明显的早期凋亡群，各浓度组间的早期凋亡率差异无统计学意义(p>0.05)，细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论 　特异性bcr/abl siRNA可显着抑制K562细胞bcr/abl融合基因的表达，抑制细胞的增殖，诱导凋亡，但其作用未显示明显的剂量依赖性。     

干扰AURKA基因表达对人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞增殖与细胞周期的影响

目的:探讨AURKA基因表达下调对骨肉瘤细胞增殖和细胞周期分布的影响?方法:脂质体瞬时转染法介导AURKA 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)处理骨肉瘤U2-OS细胞, 采用实时荧光定量PCR及 Western blot方法检测转染前后AURKA mRNA和蛋白表达,CCK8实验检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期分布变化,Western blot检测周期相关蛋白的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)细胞增殖实验检测细胞增殖情况?结果:AURKA siRNA作用U2-OS细胞后, AURKA mRNA和蛋白的表达水平较正常对照组及阴性对照组显著降低,且差异有统计学意义 (P < 0.05),两对照组间AURKA表达无明显差异;下调AURKA表达后,细胞活力降低,且作用72 h后抑制率最高,约为(36.63 ± 2.38)%;细胞周期中S期细胞比例下降,G2/M期细胞比例增加,与正常对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),提示存在G2/M期阻滞,S期细胞增殖率下降(P < 0.05),周期相关蛋白D1(Cyclin D1)表达水平下降(P < 0.05),周期相关蛋白B1(Cyclin B1)表达水平明显增加(P < 0.05)?结论:下调AURKA表达可抑制骨肉瘤细胞U2-OS的增殖, 同时导致细胞阻滞于G2/M期?