preS2反义寡核苷酸降低肝癌细胞HepG2.2.15的致瘤性

目的 :观察反义寡核苷酸 (as preS2 )对HepG2 .2 .15细胞致瘤的抑制作用。方法 :合成针对preS2翻译起始区反义寡核苷酸 ,以 10 μmol L的终浓度作用于HepG2 .2 .15细胞 ,用FACSCAN流式细胞仪检测细胞凋亡率 ,TRAP银染测定细胞端粒酶活性 ,用ABC免疫化学染色P2 1ras、P6 2 c myc蛋白 ;同时收集上清以RIA法检测血清铁蛋白浓度 ,ELISA法测定HBsAg、HBeAg浓度。体内抑瘤实验以HepG2 .2 .15细胞荷瘤裸鼠进行。结果 :as preS2可显著抑制HBsAg、HBeAg表达 ,抑制率分别为 6 6 %和 91%。as preS2作用 3d后抑制P2 1ras、P6 2 c myc蛋白表达 ,并降低肝癌细胞端粒酶活性 ,同时明显诱导细胞凋亡 (6 .13%vs 1.16 % ,P <0 .0 5 )。as preS2不影响宿主细胞自身血清铁蛋白的分泌。体外在荷HepG2 .2 .15细胞裸鼠中注射as preS2可抑制成瘤率。结论 :as preS2在体内外均能有效抑制HepG2 .2 .15细胞增殖 ,as preS2不仅抑制HBV抗原表达 ,而且明显降低肝癌细胞端粒酶活性 ,诱导肝癌细胞凋亡。     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.     

乙型肝炎病毒前S2蛋白激活人酰基蛋白硫酯酶1启动子

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白（preS2）对人酰基蛋白硫酯酶1（APT1）启动子的作用。方法生物信息学方法确定人APT1启动子序列。PCR扩增人APT1启动子和HBV preS2基因,分别插入pGL3和pcDNA3．1（－）质粒构建人APT1启动子荧光素酶报告基因质粒 pGL3‐APT1和 HBV preS2真核表达质粒 pcDNA3．1（－）‐preS2。将 pGL3‐APT1和pcDNA3．1（－）‐preS2共转染人肝癌细胞系 HepG2,然后通过检测细胞荧光素酶活性来评价 preS2对人APT1基因启动子的作用。数据用独立样本 t检验分析。结果测序结果证实pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1与实验设计相符。pGL3‐APT1的荧光素酶活性是阳性对照质粒pGL3‐Control的荧光素酶活性的1．2倍（P＜0．01）。pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1共转染HepG2细胞的荧光素酶活性为无preS2基因质粒pcDNA3．1（－）与pGL3‐APT1共转染 HepG2细胞荧光素酶活性的2．6倍（P＜0．01）。结论本研究克隆的人APT1启动子序列具有高启动子活性;HBV preS2可激活人APT1启动子。     

HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的 观察HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞株HepG2细胞内表达情况。方法 将构建的HBc与HBV多表位复合基因真核表达质粒pHBcMep以Lipofectamine介导转染HepG2细胞，通过间接免疫荧光、Western-blot检测表达产物。结果 经G418筛选的阳性转染细胞经间接免疫荧光染色后在紫外光激发时发出明显的荧光，而末转染质粒或转染pcDNA3．1的HepG2细胞则无明显荧光。Western-bot结果显示表达产物约为33kDa，并能与抗preS2多抗特异性结合。结论 HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞内获得正确表达。     

乙肝病毒研究进展

乙肝病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒,感染乙肝病毒不仅会引起急性肝炎,还可能导致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HBV可通过多种途径感染人体,引起肝病的传播。现就HBV的最新研究进展综述如下。1　HBV的结构　　HBV是目前人类感染的最小的双链DNA病毒,其编码区基本有广泛的重叠。不同病毒株的L(- )链均含有4个开放读码框,分别称为S ,C ,P ,X区。1 1　S基因　S区又分为S基因,preS1基因和preS2基因3段,它们读码框相位相同,连续串连排列,分别编码S蛋白、preS1蛋白和preS2蛋白。其中S蛋白称为主要蛋白或小蛋白,preS2 S蛋白称为中蛋白,pre…     

HBX在肝癌细胞中通过下调miR-199a增强AKT的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)调节miR-199a的表达在HBV相关性肝癌发生中的分子机制.方法 重组HBX腺病毒(Ad-HBX)感染人肝癌HepG2细胞,HBX的siRNA转染稳定表达HBV基因的人肝癌HepG2.2.15细胞,荧光定量PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、miR-199a、AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、AKT的蛋白表达水平;分别用miR-199a mimics和miR-199a inhibitor的转染肝癌细胞后,荧光定量PCR方法检测肝癌细胞中AKT的mRNA表达水平及运用Westem blot检测肝癌细胞中AKT的蛋白表达水平.结果 miR-199a在HepG2.2.15细胞中表达水平显著低于HepG2细胞,并且证实其表达下调受到了HBX的调控(P＜0.05),HepG2.2.15细胞中AKT表达水平显著高于HepG2细胞(P＜0.05),在HepG2.2.15细胞中过表达miR-199a能明显下调AKT表达水平以及在HepG2细胞中抑制miR-199a能明显上调的AKT表达水平(P＜0.05),此外,miR-199a的表达量在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低.结论 HBX可以通过miR-199a调节AKT导致HBV相关性肝癌发生.     

乙型肝炎病毒基因疫苗诱导抗体的产生

乙型肝炎病毒(HBV) 基因疫苗可打破人群对HBV 表面抗原(HBsAg) 疫苗免疫无应答或低应答而产生保护性抗体,并有可能成为治疗HBV 持续性感染的特异性基因治疗剂。我们用构建的MS2 - preS表达质粒pMIP、IL- 2 - preS原核表达质粒pIIP、IL- 2- preS真核表达质粒pCWIIP分别经小鼠尾部皮下接种。实验结果显示3 种质粒均能诱导小鼠产生抗- preS抗体,且pIIP与pCWIIP产生抗体量高于pMIP(SAS统计分析,P< 0 .01) ,这说明IL- 2 - preS基因疫苗在体内可能有多种生物学功能,同时产生协同作用。pCWIIP产生抗体量略高于pIIP(SAS统计分析,p > 0.05)     

HBV-DNA定量与HBV血清学标志物的相关性探讨

目的 探讨HBV-DNA定量与HBV血清学标志物(HBV-M)的相关性.方法 采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测449例乙肝感染者血清的HBV-DNA含量,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)对其血清学标志物进行检测.结果 在不同HBV-M模式中,HBV-DNA与preS1总检出率无显著差异.在模式HBsAg(+)、HBeAg(+)和HBcAb(+)中血清HB-DNA含量明显高于其他模式.在278例HBV-DNA阳性的标本中,HBV-DNA与preS1检出率无显著差异(P>0.05),HBV-DNA与HBeAg检出率有显著差异(P<0.01),同时preS1阳性组HBV-DNA定量值显著高于preS1阴性组.结论 HBV-DNA或preS1与HBV复制密切相关,preS1较HBeAg更能敏感反映HBV在体内的复制状况,联合检测HBV-DNA与HBV血清学标志物,在乙型肝炎的诊断治疗中更有重要的临床指导价值.     

HBV preS2-S DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答

目的:构建HBV表面抗原preS2-S基因表达质粒,并探讨其在小鼠体内的表达及诱导体液免疫应答的能力.方法:采用PCR方法,以PBR322-HBV2.0(adr亚型)质粒DNA为模板获得HBV preS2-S基因,并将其重组进入pcDNA3.0表达载体中,转染7721细胞系进行稳定表达;以此重组质粒免疫小鼠,ELISA方法检测免疫小鼠抗HBs抗体浓度.结果:构建了HBV preS2-S基因的表达质粒pcDNAS2-S,该表达质粒可在7721细胞中稳定高效表达;免疫接种小鼠2周后抗HBs抗体浓度明显升高,接种后第4周布比卡因处理组小鼠抗HBs抗体的浓度达到峰值161.4 mIU/ml,布比卡因非处理组第5周抗HBs抗体的浓度可达133.7 mIU/ml.结论:所构建的pcDNAS2-S表达质粒能有效表达并诱导小鼠体液免疫应答.     

乙型肝炎病毒通过抑制AGE-Rs表达促进AGEs诱导的肝癌细胞增殖

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对晚期糖基化终产物受体(AGE-Rs)表达及AGEs诱导下肝癌细胞增殖的影响.方法 利用HepG2.2.15细胞或肝癌细胞HepG2瞬时转染1.2倍HBV基因组,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹法(Western-blot),从mRNA水平和蛋白水平检测HBV对AGE-Rs表达...     

慢乙肝治疗性疫苗IFN-γ-preS1表位分析及卡介苗重组穿梭质粒pMV261构建

目的 运用生物信息学方法分析预测乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的前S1(preS1)蛋白和重组IFN-γ-preS1蛋白的T、B细胞优势表位，构建卡介苗(Bacille calmette-guérin, BCG)重组pMV261穿梭质粒。方法 NCBI数据库中获取γ干扰素(Interferon γ,IFN-γ)和preS1的氨基酸序列，应用I-TASSER构建三级结构并对重组蛋白进行免疫模拟。利用SnapGene软件将重组IFN-γ-preS1蛋白全长基因插入大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261中，构建BCG重组pMV261。结果 preS1蛋白与重组IFN-γ-preS1蛋白分别由118和299个氨基酸组成。IFN-γ蛋白与特异性抗原preS1蛋白进行融合后，preS1蛋白的亲水性、稳定性均未发生改变，其二级结构和三级结构亦能正常表达。preS1蛋白经重组后，其B细胞抗原表位由preS1蛋白的4～18位、25～40位和41～59位氨基酸分别变为重组IFN-γ-preS1蛋白的185～199位、207～221和222～242位氨基酸，其余未发生改变；其T...     

乙肝病毒核酸疫苗诱导BALB/c小鼠特异性免疫应答

目的 现察舍乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)preS2S基因的核酸疫苗免疫小鼠后的特异性免疫应答.方法 将BALB/c小鼠随机分为4组分别肌肉接种pCMV-S2S、乙肝表面抗原(HBsA8)、空载质粒(pCMV)及生理盐水(NS).免疫组织化学法检测接种局部组织preS2S抗原的表达,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体Anti-HBs.结果 pCMV-S2S组小鼠肌肉细胞中有较多量的preS2S蛋白表达,其它小鼠肌肉细胞中均未检出preS2S蛋白表达.pCMV-S2S组小鼠CTL活性为(32.10±1.93)%,明显高于各对照组(P＜0.05).pCMV-S2S组小鼠8周后Anti-HBs阳性率最高为42.9%.HBsAg组小鼠4周时Anti-HBs阳性率即达到100%.pCMV组及NS组小鼠血清中均未检测出Anti-HBs.结论 乙肝核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内表达preS2S蛋白,并能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,也能诱生一定程度的特异性体液免疫应答.     

热休克蛋白B1抑制HBV复制的研究

目的 探讨热休克蛋白B1 (heat shock protein B1,HSPB1)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 采用Western blot检测正常肝细胞系(HepRG)和HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中HSPB1的蛋白水平.在HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中转染pCMV6-HSPB1质粒及对照质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对HBV复制中间体表达的影响;qRT-PCR检测HSPB1过表达对HBV3.5 kb mRNA表达的影响;ELISA检测HSPB1过表达对HBV s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响.在肝癌细胞系Huh-7中共转染pCH9/3091和pCMV6-HSPB1质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对瞬时转染的HBV复制中间体表达的影响.结果 HSBP1在HepAD38和HepG2.2.15中的表达明显低于HepRG.HSPB1在HepAD38和HepG2.2.15细胞中成功过表达,在过表达HSPB1的HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体水平以及3.5 kb mRNA水平均降低,细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平也降低.HSPB1在转染pCH9/3091的Huh-7细胞中成功过表达,HSPB1过表达抑制了瞬时表达的HBV的复制水平.结论 HSPB1可以抑制HBV复制.     

肝癌细胞系中DNMTs表达的检测及意义

目的:检测HBV相关肝癌细胞系(Hep3B)与非HBV相关肝癌细胞系(HepG2)中甲基化转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)的表达,分析HBV感染与DNMT表达之间的关系。方法:应用荧光定量PCR(Flurescencequantitative-PCR,FQ-PCR)检测两种肝癌细胞系中DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、GAPDH基因mRNA表达水平,并将DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B表达水平与参比基因进行比较。结果:DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B在HBV相关细胞系Hep3B中表达分别为:1.26±0.15、0.76±0.15、1.26±0.20、0.66±0.13;在非HBV相关肝癌细胞系HepG2中的表达分别为:0.64±0.11、0.62±0.12、0.48±0.12、0.36±0.10。Hep3B细胞系中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达均高于HepG2(P均<0.01)。结论:⑴HBV相关肝癌细胞系Hep3B中存在DNMT过表达;⑵HBV感染可能刺激DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达,进而促进抑癌基因甲基化。     

HBV对肝癌细胞中MIA2表达的影响

目的探讨黑色素瘤抑制蛋白2(MIA2)在肝癌细胞中的表达水平与乙型肝炎病毒(HBV)感染状态的关系。方法培养人肝癌细胞株HepG2和持续表达乙肝病毒的人肝癌细胞株HepG2.2.15,采用细胞免疫组织化学和蛋白免疫印迹检测(Western blotting)2种细胞株中MIA2蛋白表达水平差异。结果 MIA2蛋白在HepG2.2.15细胞株中的表达水平较HepG2细胞株减低,差异有统计学意义。结论 MIA2蛋白在HBV阳性肝癌细胞中表达水平减低,提示HBV感染可能通过抑制MIA2的表达导致肝癌发生。     

异质性胞核核糖核蛋白K在肝癌组织及不同密度肝癌细胞中的表达

目的:观察异质性胞核核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNP K)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及在不同密度肝癌细胞(PLC/PRF/5)中的亚细胞定位.方法:免疫组化染色观察肝细胞癌组织中hnRNP K的表达;Western印迹检测肝癌组织(n=30)及对应癌旁组织hnRNP K蛋白表达差异;应用细胞免疫组化和Western印迹法比较不同密度肝癌细胞hnRNP K蛋白的亚细胞定位及表达.结果:肝细胞癌组织hnRNP K蛋白主要表达于细胞核.hnRNP K蛋白表达在30例的肝癌组织中有21例高于其对应的癌旁组织;20例HBV阳性肝癌组织有16例高于其对应的癌旁组织,而10例HBV阴性肝癌组织仅有5例表达高于癌旁组织.细胞免疫组化结果表明,hnRNP K主要表达于PLC细胞核中,并且随密度(汇合率为30%、50%、90%)的上升,其表达量逐渐上升.Western印迹结果表明,不同密度(汇合率为30%、50%、70%、90%)肝癌细胞的细胞质中,hnRNP K的表达量无统计学差异;而在细胞核中,随着细胞密度的增大,hnRNP K的表达量逐渐升高.结论:肝癌组织细胞核hnRNP K表达上调,且随着肝癌细胞密度的增加,其表达会逐渐增强,HBV感染可能会促进其表达.     

YTHDF1对HBV蛋白表达和HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用

目的:探讨YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTHDF1）对乙型肝炎病毒（HBV）蛋白表达和抗原分泌的影响。方法:分别以pCD3/Flag-KBE和pSilencer2.1-U6 neo为载体,构建过表达和敲降YTHDF1质粒。在Huh7细胞中过表达HBV蛋白质粒的同时表达pshR-YTHDF1和对照质粒,通过Western印迹检测YTHDF1对HBV蛋白表达的影响。在HepG2.2.15细胞中过表达和敲降YTHDF1, 在Huh7细胞中同时过表达pHBV1.3质粒,通过ELISA检测YTHDF1对HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。结果:与正常肝细胞相比,YTHDF1在肝癌细胞Huh7（t=17.4）、HepG2.2.15细胞中（t=39.6）高表达。成功构建过表达和敲降YTHDF1质粒并验证其有效。敲降YTHDF1抑制HBV基因组编码的HBc蛋白（t=9.5）、HBs蛋白（t=5.2）、preS1蛋白（t=25.7）、preS2蛋白（t=9.0）、HBx蛋白（t=19.7）、HBV DNA Pol蛋白（t=23.0）表达,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。过表达YTHDF1促进HBsAg（Huh7细胞t48 h=5.5,t72 h=5.0;HepG2.2.15细胞 t48 h=5.3,t72 h=27.4）、HBeAg抗原（Huh7细胞t48 h=5.7,t72 h=6.3;HepG2.2.15细胞t48 h=29.0,t72 h=6.6）的分泌,而敲降YTHDF1抑制HBsAg（Huh7细胞t48 h=16.0,t72 h=7.9;HepG2.2.15细胞t48 h=22.3,t72 h=7.0）、HBeAg抗原（Huh7细胞t48 h=9.0,t72 h=14.3;HepG2.2.15细胞t48 h=8.1,t72 h=6.6）的分泌（均P＜0.05）。结论:YTHDF1可能具有增加HBV蛋白表达及促进HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用。     

miR-583靶向调控DDX5促进HBV复制和表达

目的 探讨miR-583对乙型肝炎病毒(HBV)复制、表达的影响及相关作用机制.方法 体外培养人肝癌细胞HepG2、人稳转HBV病毒的肝癌细胞HepG2.2.15,并将HepG2.2.15分为空白对照组、NC-siRNA组(转染NC-siRNA)及miR-583 siRNA组(转染miR-583 siRNA).实时荧光...     

乙型肝炎病毒X基因在HepG2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响.方法用分子克隆方法构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞,以转染空载体pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照,抽提RNA,进行RT-PCR,检测HBV X基因的表达.以β-actin为内参,用半定量RT-PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasL mRNA相对表达量的变化.结果重组真核表达载体经RT-PCR及DNA测序均检测出HBV X特异性片段,pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.转染HBx的细胞Fas与FasL mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论成功构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,转染入HepG2肝癌细胞,并在该细胞中表达.HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达.     

双拷贝和x基因缺失HBV DNA质粒的构建及其细胞转染

目的:构建双拷贝和x基因缺失的HBV真核细胞复制表达质粒,并研究其在Hep3B肝癌细胞株中对HBV的复制表达效果.方法:利用含HBV DNA(adrⅠ)的质粒,酶切出HBV DNA片段,克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3,构建双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;将原始质粒通过插入人工合成DNA片段和基因重组破坏乙肝病毒x基因区,再克隆入pcDNA3,构建成pcDNA3-KN-F1F2真核表达质粒;用两质粒分别转染Hep3B肝癌细胞株,进行G418筛选的同时用荧光定量PCR法检测细胞培养上清液HBV DNA.结果:(1)成功构建了x基因缺失的HBV真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2及含双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;(2)对两质粒成功进行细胞转染后,测得第3、6、14天细胞培养上清液中HBV DNA均高表达,两质粒之间差别不明显.结论:构建的质粒可在Hep3B细胞株中表达并引起HBV的复制及分泌;x基因的缺失不影响HBV在Hep3B细胞株中的表达复制.