应用抑制性差减杂交技术克隆小鼠胸腺细胞发育相关新基因

目的:克隆胸腺细胞发育相关新基因.方法:应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库,结合RACE及RT-PCR进一步克隆并验证新基因的cDNA全长序列.结果:筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了差异表达的cDNA片段,克隆后挑选阳性克隆进行测序,成功克隆8个新基因片段.对其中两个新基因克隆C55和C91进行Northern杂交分析,mRNA转录体长度分别为1.4 kb及1.5 kb,C55的表达在两种胸腺基质细胞系中存在显著差异.进一步克隆了C55和C91两个新基因的cDNA全长序列,已被GenBank所接受.结论:抑制性差减杂交技术是克隆新基因片段的有效方法;成功克隆8个新基因片段及两个新基因的cDNA全长序列.     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

大鼠肝再生中1个表达上调新基因的克隆表达及分析

目的　克隆肝再生相关新基因。方法　以抑制性消减杂交得到的1个EST为模板制备探针,运用Southern印迹方法,从构建的再生肝76 h c DNA文库中调取了它的c DNA全长,并利用基因原核表达技术,表达并纯化出它的蛋白产物,制作了该蛋白的兔源多抗,分别用所制该基因的探针,采用点杂交技术检测了0～76 h的再生肝材料。结果　获得了1个新基因全长,BL AST检索结果为1未知功能基因,暂时命名为liver regeneration relatedprotein(L RRP) ,大鼠基因组数据库中检索结果证实L RRP位于19q12且由4个外显子和3个内含子组成,递交Gen Bank获登录号为AY0 98917。表达纯化出了它的融合蛋白产物,并得到了它的多克隆抗体。点杂交结果也证实了基因在肝切除后76 h明显上调。结论　L RRP基因全长的克隆和它的高效多克隆抗体的获得为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

直接获得差异表达基因全长cDNA的改良消减杂交方法

目的：探索一种可以直接克隆差异表达基因全长cDNA的方法。方法：结合Clontech公司的“SMART PCR”cDNA合成技术和Promega公司的生物素．磁珠亲和技术．以鼻咽癌耐药细胞系CNE2／DDP及其素代细胞CNE2为研究时象．采用一种基于PCR技术的改良消减杂交方法筛选并克隆耐药相关基因。点杂交鉴定排除假阳性．对部分差异表达片段测序并进行序列分析,RT-PCR对差异表达的基因片段做进一步验证。结果：用此方法建立了可以克隆差异表达基因cDNA全长的双向消减文库。经过对部分差异表达片段测序和序列分析．获得了6个耐药细胞差异表达的基因片断。其中5个有完整的开放读框．可能代表耐药相关的差异表达基因。对此5个序列登录GenBank并获得登录号为AY196929．196933。结论：改良的消减杂交方法是克隆差异表达基因的有效方法。应用此方法研究发现,有多个功能已知和未知的基因通过上调或降低其表达参与了鼻咽癌耐药性的产生。     

葡萄胎发病相关新基因的克隆

目的筛选和克隆与葡萄胎发病相关的新基因。方法采用抑制性消减杂交方法，建立葡萄胎组织与正常早孕绒毛组织间的差示cDNA文库，从中筛选出新基因序列，并克隆其全长。结果从差示cDNA文库中共筛选出28个克隆，测序结果提示含10种基因序列，其中3个基因片段被确认为功能未明的新基因，并获得其中一条基因的全长序列（按克隆序列号命名为F10）。结论F10等新基因可能与葡萄胎的病理发生发展密切相关。     

应用抑制性差减杂交技术构建铁皮石斛差减cDNA文库的探讨

【目的】探讨构建铁皮石斛抑制差减文库的方法,为克隆石斛碱生物合成相关功能基因奠定基础。【方法】采用抑制性差减杂交(SSH)技术,分别以4年生和1年生铁皮石斛叶片互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为检测子(tester)与驱赶子(driver),将所获得差减cDNA片段克隆入质粒表达载体(Point^TMXa-1 T-Vector),转化大肠杆菌JM109,聚合酶链反应(PCR)扩增鉴定插入片段。【结果】成功地构建了与石斛碱生物合成相关的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含560、220个重组子;插入片段的平均大小为550bp。【结论】所构建的差减cDNA文库适合进一步克隆分析石斛碱相关功能基因研究。     

乙型肝炎病毒X抗原转导细胞差示表达全长基因C2的克隆及初步？…

目的 克隆乙型肝炎病毒Ｘ抗原（ＨＢｘＡｇ）相关肝癌差示表达基因并做功能研究。方法 （１）用逆转录病表达ＨＢｘＡｇ细胞模型。（２）用抑制差减杂文做基因差示表达分析。（３）做ＲＮＡ印迹分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｍ Ｂｌｏｔ）及原位分子杂交筛选基因探针。（４）用５＇和３＇迅速未扩增法（ＲＡＣＥ ＰＣＲ进行全长基因序列扩增，并进行体外蛋白翻译及制备抗体，做蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）分析。（５）进行     

小鼠FasL全长cDNA的克隆、真核表达载体构建及其在树突状细胞中的表达

目的 克隆小鼠FasL(mouse FasL,mFasL)全长cDNA,构建其真核表达载体,并验证其在小鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells,DC)中的表达.方法 采用RT-PCR和TA克隆技术,从激活的小鼠脾脏T淋巴细胞中扩增mFasL全长cDNA,亚克隆到T载体中,再克隆到pIRES2EGFP载体中.转染小鼠DC后,用RT-PCR、免疫荧光及Western blot检测mFasL mRNA和蛋白表达.结果 测序证实所得的mFasL cDNA序列与其在GenBank中的序列完全一致.mFasL真核表达载体转染小鼠DC后,能表达mFasL mRNA和蛋白.结论 成功克隆了mFasL基因,构建其真核表达载体,并证明能有效表达于DC中.     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因,为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术,以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象,构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行差异筛选,对所得的差异片段进行测序和同源性分析,利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减文库分别含有235和232个白色克隆,90%以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选。共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因,GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

Screening and analysis of differentially expressed genes of dermal papillae cells with aggregative behavior

Objective: To screen and clone differentially expressed genes of dermal papillae cells (DPC) with aggregative behavior, and to explore the molecular mechanism of their aggregation. Methods: Total RNAs were extracted from DPC with and without aggregative behavior and double strand cDNAs were synthesized by using SMART cDNA synthesis, respectively.The cDNA fragments of differentially expressed genes in DPCs with aggregative behavior were isolated by suppression subtractive hybridization. Positive clones were screened by PCR method and verified by cDNA dot blot, Northern blot and then analyzed through homologous retrieving. Results: A subtractive cDNA library of DPC with aggregative behavior has been successfully constructed. The result of screening and cloniog of the library showed that, DPC with aggregative behavior could expresse genes related to homologous aggregation, proliferation and cycle control, including known genes (capping protein,paladin, vascular endothelial growth factor), hematopoietic stem/progenitor cells (HSPC) related clone ( HSPC011 and HSPC016) and a new gene. Conclusion: The construction of subtracted library of DPC lays solid foundation for screening and cloning new and specific genes related to aggregative behavior of DPC. Several genes might be cooperatively involved in the homologous aggregation, proliferation and cycle control of DPC.Among these genes, capping protein and palladin might be closely related to the aggregative behavior of dermal papilla cells, and VEGF and HSPC related clone would be responsible for the status of higher proliferation of dermal papilla cells.     

应用抑制性消减杂交技术从斑秃脱发区毛乳头中克隆出一条自身抗原基因

目的　寻找斑秃脱发区毛乳头中特异表达的基因片段 ,探讨斑秃发病机制。方法　应用抑制性消减杂交构建斑秃脱发区毛乳头差异表达基因的cDNA文库 ,并通过PCR筛选、杂交验证和同源性检索对差异表达基因进行分析。结果　成功建立了高消减效率的斑秃脱发区毛乳头cDNA消减文库 ,并克隆到一条斑秃毛乳头特异表达的基因片段DP3( 3 0 7bp) ,应用cDNA斑点杂交及Northern杂交证实它仅在脱发区毛乳头特异表达 ,同源性检索其为一条甲状腺相关的自身抗原基因。结论　DP3在斑秃脱发区毛乳头的特异表达提示其可能参与斑秃的发病过程 ,它的克隆为斑秃发病机制的自身免疫学说进一步提供了实验依据     

人脐静脉内皮细胞脂多糖刺激后上调基因表达谱的分析

目的 对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)受脂多糖(LPS)刺激后上调基因表达谱进行筛选及分析。方法 以受LPS刺激HUVEC为实验方，末刺激别HUVEC为驱使方，进行抑制消减杂交(SSH)建立消减cDNA文库，经菌落原位斑点杂交筛选文库后将阳性克隆测序和同源性分析，并用RT-PCR验证新的cDNA序列。结果 共获得25条上调表达的基因，分别与炎症反应、细胞骨架重构、细胞生长和凋亡、胞内信号转导相关，并克隆到3条新基因表达序列标签(EST)，RT-PCR验证了这些新EST序列只在LPS刺激的内皮细胞中表达。结论 抑制消减杂交有效地克隆了人脐静脉内皮细胞LPS刺激后上调表达基因，有助于阐明LPS直接激活血管内皮细胞的分子机制。     

大劣按蚊AdS7基因的克隆及分析

目的克隆AdS7基因cDNA序列,为大劣按蚊基因定量研究提供内参照.方法采用RT-PCR扩增、TA克隆技术获得AdS7 cDNA部分序列,标记地高辛AdS7探针,从大劣按蚊cDNA文库中筛选得到AdS7全长克隆,以半定量RT-PCR方法研究血餐和约氏疟原虫感染对其表达水平的影响.结果从大劣按蚊cDNA克隆得到长464 bp的AdS7基因cDNA部分序列,从大劣按蚊cDNA文库筛选获得了长871 bp的AdS7基因全长克隆,大劣按蚊吸血和感染约氏疟原虫后24 h,AdS7表达水平没有显著变化.结论 AdS7基因可作为大劣按蚊基因定量研究的内参照.     

肾癌差异表达基因克隆的研究

目的 克隆并鉴定肾癌与正常肾之间差异表达的基因。方法 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌差异表达的基因。结果 构建成功了高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,对其中5个克隆插入的cDNA片段进行测序后经Genbank检索表明,5个片段均为未知新序列,其中GYIZ-RCC18为3个拷贝,提示以上5个cDNA征段可能来自3个新基因。Northern杂交分析显示,GYIZ-RCC18在肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,这证明GYIZ-RCC18是肾癌相关的新基因。结论 人肾癌cDNA消减文库的建立为进一步筛选,克隆肾癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

脑胶质瘤患者全长新基因的获得及初步研究

目的 探讨基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因,并对其中一条基因进行初步研究。方法 抽提正常成人脑组织与人脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机观察两者表达谱的差异情况,对507E08克隆子进行了Northern印迹、原位杂交、生物信息学分析和染色体定位。结果 通过4次基因芯片筛选,获得15条与胶质瘤相关的新基因,经Northern印迹证实507E08基因在人正常脑组织中低表达,而在人脑胶质瘤中高表达。原位杂交得到相同的结果。BLASTn和BLASTx分析显示,507E08基因为全长新基因,长度为2002bp,共编码203个氨基酸。本基因命名为人核糖体蛋白L14．22。该基因定位于14号染色体上D14S1066和D14S265Marker之间。结论 用基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因,具有样品用量少,高质量,高速度,高敏感等特性。507E08基因可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究

目的：筛选并克隆丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）反式激活新型靶基因。方法：以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆，其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，通过序列同源性比对和电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从转染peDNA3．1（-）-NS4A的HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术扩增获得该新基因的全长序列，并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果：该新基因的编码序列全长为963个核苷酸（nt），编码产物由321个氨基酸残基（aa）组成，并测序证实，命名为NS4ATP1，在GenBank中注册，注册号为AY740521。结论：分子生物学技术与生物信息学技术相结合，发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1，为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

肝细胞癌候选相关基因IDD01的克隆与鉴定

目的鉴定表达序列标签(EST)在肝细胞癌(HCC)和癌旁非癌组织表达,扩增其全长.方法采用半定量RT-PCR方法,对21例HCC患者的癌组织和癌旁非癌组织EST mRNA的表达情况进行检测,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增、测序获得全长,Blast检索GenBank.结果此EST在HCC癌组织中高表达,癌旁非癌组织中低表达(P＜0.05);序列全长为1 333 bp,含有完整开放阅读框(ORF)和Poly(A)尾;Blast检索为一功能未知基因.结论获得一个和HCC相关候选新基因,为进一步研究其功能打下基础.     

Suppression subtractive hybridization for identifying differentially expressed genes in renal cell carcinoma

Objective To construct a renal cell carcinoma (RCC) cDNA subtractive library using suppres sion subtractive hybridization.Methods Polyadenylated RNA ［Poly (A)(+) RNA］ was isolated from tissues of RCC and norm al kidney, and single- strand cDNAs and double-strand cDNAs were synthesized in turn. RCC cDNAs were divided into two groups and ligated to the specific adaptors l and 2, and then h ybridized with normal kidney cDNA twice with two rounds of suppression PCR. Sec ond round PCR products were cloned to T/A plasmid vectors to set up the subtract ive library. One hundred clones were randomly picked to perform enzyme digest a nalysis, and some underwent sequence analysis and Northern blot to identify RCC specifically expressed genes. SMART RACE procedure was operated to clone full l ength novel RCC specifically expressed genes.Results A human RCC subtractive library with high subtractive efficiency was successfull y set up. The amplified library contains 350 positive clones. Random analysis of 100 clones with enzyme restriction showed that 85 plasmids in the clones cont ained 50-400 bp inserts. Sequence analysis was performed for 10 clones. All t he 10 sequences were unknown before and derived from 6 unique, novel genes among which the cDNA insert RCC18 had five copies. Northern blot analysis showed tha t RCC18 cDNA was highly expressed in RCC, but no signal could be detected in nor mal kidney. Using SMART RACE technique, we obtained the full length of the nove l gene RCC18.Conclusions The constructed cDNA subtractive library of human RCC is a highly efficient one and lays a solid foundation for large scale screening and cloning new and speci fic oncogenes or tumor suppressor genes of RCC. The novel specifically expresse d genes provided an important clue for studying the mechanisms of occurrence and development of RCC.     

人类cyclophilin A基因cDNA的克隆和序列测定

目的:克隆人类环孢霉素A受体亚型cyclophilinA(CypA)基因,对该基因进行序列测定。方法:利用EST重叠序列拼排技术,设计特异性CypA引物,以人外周血白细胞总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,纯化PCR产物,装pGEM-T载体,进行DNA序列测定。结果:成功克隆了人类Cyp A基因cDNA序列的开放阅读框,经DNA序列测定证实序列正确。结论:通过克隆人CypA基因,并克隆人pGEM-T载体,为下一步的基因表达和功能研究奠定了实验基础。     

应用抑制性消减杂交筛选大鼠不同程度肝纤维化的上调基因

目的应用抑制消减杂交技术,筛选大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化和重度肝纤维化组织中差异表达的上调基因。方法利用抑制消减杂交技术,构建大鼠轻度肝纤维化和重度肝纤维化2个差异cDNA文库,并挑选36条上调显著的基因进行测序鉴定。结果获得1152个克隆,其中有1036个含有插入片段。挑选32个克隆测序,与GenBank数据库进行初步比较,其中28条与已知基因的部分序列高度同源。结论应用抑制消减杂交技术成功构建了轻度肝纤维化和重度肝纤维化差异表达基因的cDNA削减文库,为进一步研究肝纤维化发生、发展和逆转的机制奠定了理论基础。