dn HIF-1α对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的 研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用.方法 将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较.结果 重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05).转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达.提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用.     

dn HIF-1对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用。方法将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况,同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较。结果重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05)。转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达。提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用。     

氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响

目的 对已构建的突变型人低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala(单突变)和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala(双突变)进行进一步的功能鉴定.方法 将pcDNA3.1+/HIF-1α、pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala分别用脂质体法短暂转染人胚肾上皮细胞(human embryo kidney 293,HEK293);Western blotting法检测正常氧、低氧无钙离子或有钙离子条件下各组转染细胞HIF-1α蛋白水平:RT-PCR法检测正常氧条件各组转染细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达.结果 正常氧条件下,转染突变体的细胞较转染野生型HIF-1α载体的细胞HIF-1α蛋白和VEGFmRNA水平增高;低氧条件下,转染野生型HIF-1α载体的HEK293细胞HIF-1α蛋白水平增高:Ca~(2+)刺激减少低氧时转染野生型HIF-1α载体细胞HIF-1α蛋白水平,但对转染突变体细胞HIF-1α蛋白水平无明显影响.结论 pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala两种突变体产物在蛋白水平上具耐氧和耐蛋白酶降解的特性.

Abstract：

Objective To study the effects of oxygen and calcium on the expression of eukaryotic vectors harboring wild-type or mutated hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in HEK293 cells.Methods HEK293 cells were transiently transfected with pcDNA3.1+/HIF-1α,pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala via lipofectin.Western blotting were used to detect HIF-1α protein after normoxic or hypoxic exposure of the transfected HEK293 cells in the presence or absence of Ca~(2+).The levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA in the transfected cells in normoxic condition was detected using RT-PCR.Results The levels of HIF-1α protein and VEGF mRNA increased in HEK293 cells transfected with the vectors harboring mutated HIF-1α, but not in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors in normoxia.Hyooxia increased the levels of HIF-1α protein in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors,which was inhibited by the application of Ca~(2+). Ca~(2+) showed no inhibitory effect on HIF-1α levels in HEK293 cells transfected with the vectors containing mutated HIF-1α. Conclusion The protein products of pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala in HEK293 cells enhance the cell tolerance to oxygen and protease.     

HIF-1α对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用.方法 将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full lengthHIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染人SiHa细胞中,分别命名为fL HIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组.应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测.应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况.结果 免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下.fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pc DNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在官颈癌的发生发展中可能起着重要作用.     

人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)中的表达。方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列。用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析。结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确。经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞。结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达。     

干扰 Krüppel 样因子 8表达对肝癌 SMMC7721细胞中血管生成相关因子的调控作用

目的：构建Krüppel样因子8（Krüppel-like factor 8,KLF8）的真核表达质粒及干扰质粒,考查KLF8对人肝癌SMMC7721 细胞中血管生成相关因子的调控作用。方法：构建KLF8的真核表达质粒pcDNA3.1-KLF8,测序确认。构建靶向不同KLF8干扰位点的干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-KLF8,筛选出干扰效率最高的pGPU6/GFP/Neo-KLF8。将pcDNA3.1-KLF8、相应的对照质粒 pcDNA3.1,pGPU6/GFP/Neo-KLF8、相应的对照质粒pGPU6/GFP/Neo-ShNC 分别转染人肝癌SMMC7721细胞,共４组。实时荧光定量PCR及Western blot检测KLF8的表达,qPCR检测各组细胞中低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）1-α、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管生成素（angiopoietin,Ang）1、Ang2、血管生成素受体Tie2及基质金属蛋白酶（matrix metallo-proteinase,MMP）2的mRNA表达。结果：pcDNA3.1-KLF8显著上调KLF8表达（相对表达量为68.8±6.5）,pGPU6/GFP/Neo-KLF8下调KLF8的表达（相对表达量 0.31±0.01）。转染pcDNA3.1-KLF8组与其对照组相比,VEGF、Ang2、HIF1-α及MMP2 mRNA表达增加（P<0.05）,血管生成素受体Tie2、Ang1的mRNA表达无差异（P ＞0.05）;转染pGPU6/GFP/Neo-KLF8组与其对照组相比,Ang2和HIF1-α表达降低（P<0.05）,VEGF、血管生成素受体Tie2、Ang1及MMP2的表达无差异（P ＞0.05）。结论：在肝癌中,KLF8可能通过调控VEGF、Ang2、HIF1-α及MMP2来调控血管生成。     

沉默乏氧诱导因子-1α基因对乏氧人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响

目的探讨RNA干扰乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因对CoCl2诱导的乏氧人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响及其机制。方法利用分子生物学技术构建靶向HIF-1α基因的RNA干扰质粒pGenesil-HIF,脂质体介导转染SMMC-7721细胞后进行乏氧培养,分别采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α基因的mRNA和蛋白表达,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性的变化。结果酶切鉴定和测序证实重组质粒pGenesil-HIF构建正确,转染质粒后乏氧培养24 h,SMMC-7721细胞HIF-1α基因的mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组和阴性干扰组（P〈0.05或P〈0.01）;乏氧培养24 h、48 h和72 h后,HIF-1α干扰组细胞增殖活性明显低于对照组（P〈0.05或P〈0.01）,细胞阻滞于G0/G1期（P〈0.01）;乏氧培养48 h和72 h后HIF-1α干扰组细胞凋亡百分率明显高于对照组（P〈0.01）;乏氧培养72 h后HIF-1α干扰组SMMC-7721细胞放射增敏比为1.45。结论 RNA干扰HIF-1α基因可增强乏氧人肝癌细胞SMMC-7721的放射敏感性,其机制可能与RNA干扰HIF-1α基因抑制乏氧细胞增殖和诱导凋亡有关。     

HIF-1对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用。方法将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染入SiHa细胞中,分别命名为fLHIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组。应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测。应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。结果免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下,fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pcDNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

蜂毒素对骨肉瘤Saos-2细胞系HIF-1α及VEGF表达的影响

目的：研究低氧条件下蜂毒素（melittin）对骨肉瘤Saos-2细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,探讨蜂毒素抗骨肉瘤细胞血管生成的机制。方法：分别设空白对照组和低氧对照组,以及加入终浓度为2、4、8μg/ml的蜂毒素组;采用免疫印迹试验（Western—blot）检测细胞HIF-1α蛋白表达,逆转录RT—PCR检测HIF-1α和VEGFmRNA转录水平的变化。结果：与空白对照组比较,低氧对照组细胞中HIF-1α的蛋白表达及VEGF的mRNA表达均明显升高（P〈0．05）;蜂毒素组细胞的HIF-1α蛋白表达明显低于低氧对照组（P〈0．05）,并具有剂量依赖性;蜂毒素组细胞的VEGF mRNA水平明显低于低氧对照组（P〈0．05）,且有剂量依赖性。结论：模拟的低氧条件可以诱导骨肉瘤Saos-2细胞系中HIF-1α通路的激活;蜂毒素通过抑制HIF-1α蛋白水平的表达、影响其通路中下游基因VEGF mRNA水平的表达而抑制骨肉瘤Saos-2细胞中低氧诱导的HIF-1α通路的激活。由此推断蜂毒素可能通过此途径抑制骨肉瘤血管的生成,达到抗肿瘤的效果。     

RI基因真核表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞的影响

目的构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,并检测核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因与血管生成素(angiogenin,ANG)的关系及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法用RT-PCR方法扩增RI基因,酶切后将其插入pcDNA3.1,构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,在脂质体介导下转染HUVECs,RT-PCR检测RI、ANG基因的mRNA表达水平;Western blot检测RI、ANG、MMP-2、MMP-9的表达水平;CO-IP法检测ANG和RI的相互作用,MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果真核表达质粒构建成功;转染pcDNA3.1-RI组细胞RI基因的mRNA及蛋白的表达较2个对照组(转染pcDNA3.1空载体组和未转染质粒组)均呈显著性增加(P<0.05),而ANG基因的mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表达水平亦降低(P<0.05);CO-IP法检测到ANG和RI在细胞内能结合;转染pcDNA3.1-RI质粒到HUVECs细胞后细胞的增殖活力明显降低(P<0.05),G0～G1期比例明显增加,S期减少。结论成功构建的真核表达质粒能显著增加RI基因及其蛋白水平的表达,RI可以直接在转录水平上降低ANG的表达,在细胞内与ANG结合,从而影响内皮细胞的增殖、迁移能力。     

RNA干扰HIF-1α对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的VEGF表达及增殖的影响

目的 探讨shRNA特异性干扰沉默缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）的血管内皮生长因子（VEGF）表达及其增殖的影响.方法 获取9例RA患者滑膜组织进行RA-FLS的分离培养及传代.将FLS分为4组：常氧组、缺氧组、阴性质粒组（转染阴性质粒）和阳性质粒组（转染HIF-1α阳性质粒）,常氧组进行常规培养,后3组进行缺氧培养12h;采用Western blot和qRT-PCR法分别检测各组FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达情况.将缺氧组、阴性质粒组和阳性质粒组的FLS分别于缺氧条件下培养6、12、24、48h,应用MTT比色法检测各组细胞增殖情况.结果 与常氧组相比,缺氧组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达明显升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而阴性质粒组和缺氧组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达水平无明显差异（P＞0.05）;阳性质粒组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA较缺氧组下调,差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）.4组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表达呈正相关（P＜0.01）.缺氧培养12h后阳性质粒组的FLS生长较缺氧对照组及阴性质粒组减慢,差异有统计学意义（P＜0.05）,而后两组FLS生长无统计学差异（P＞0.05）.结论 RNA干扰HIF-1α表达能有效下调RA-FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA水平,并且能抑制FLS的异常增殖.     

HIF-2α-VEGF-Notch信号通路在高强度聚焦超声不完全消融后肝癌中的作用

目的 探讨HIF-1α、HIF-2α、VEGF、Notch等基因在高强度聚焦超声不完全消融肝癌血管新生中的表达及其作用.方法 实验共分5组,HIFU残留肝癌细胞亚系为实验组,未处理肝癌细胞为对照组,转染HIF-2α基因沉默重组慢病毒残留肝癌细胞为抑制HIF-2α组,转染VEGF基因沉默重组慢病毒残留肝癌细胞为抑制VEGF组,转染空载慢病毒残留肝癌细胞为空载组.免疫荧光检测实验组与对照组的VEGF表达.低氧(1％O2)处理实验组与对照组细胞0、6、12、24 h,荧光定量PCR和Westernblot检测HIF-1α、HIF-2α、VEGF mRNA和蛋白表达水平.荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞HIF-1α、HIF-2α、VEGF、Notch、DLL4 mRNA和蛋白表达水平.结果 VEGF蛋白在对照组与实验组细胞中均有表达.HIF-1α在低氧处理12 h达到顶峰,随后下降,而HIF-2α、VEGF随着低氧处理时间增加而呈上升趋势,且实验组HIF-2α、VEGF表达较对照组明显增高(P＜0.05).转染慢病毒后,抑制HIF-2α组HIF-2α、VEGF mRNA和蛋白表达均较实验组显著下调(P＜0.05),抑制VEGF组VEGF、Notch、DLL4mRNA和蛋白表达均较实验组显著下调(P＜0.05),实验组HIF-2α、VEGF、Notch、DLL4mRNA和蛋白表达均高于对照组(P＜0.05).结论 HIF-2α-VEGF-Notch信号通路参与调控高强度聚焦超声残余肝癌血管新生.     

乏氧对人舌鳞癌Tca8113细胞HIF-1α表达影响的研究

目的 初步研究乏氧对人舌鳞癌Tca8113细胞HIF-1α表达水平的影响.方法 将处于对数生长期的Tca8113细胞置于1%O2、5%CO2、94%N2混合气体的乏氧培养箱内培养,分别在乏氧培养1/2、1、3、6、12和24 h时取出.每个时间段均设常氧培养对照组(5%CO2、95%O2).采用RT-PCR技术检测不同培养条件下细胞HIF-1α mRNA的表达情况.结果 HIF-1α的表达在乏氧12 h明显升高并达最高峰,24 h时又下降至常氧水平.每个时间段乏氧组HIF-1α的表达均高于其相应的常氧对照组.结论 乏氧影响了人舌鳞癌Tca8113细胞HIF-1α基因的表达水平,肿瘤细胞通过上调HIF-1α基因的表达适应肿瘤乏氧的微环境,有利于肿瘤的发生与发展.     

乏氧诱导的自噬与肺腺癌放射抵抗的相关性研究

目的 研究乏氧诱导的自噬与肺腺癌放射抵抗之间的相关性.方法 肺腺癌A549细胞行常氧和乏氧培养.构建靶向抑制乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)的shRNA表达质粒,转染乏氧A549细胞,筛选稳定表达的克隆细胞.克隆形成实验检测细胞放射敏感性.Western blot法检测各处理组细胞HIF-1α、beclin1蛋白的表达.结果 乏氧细胞存活分数(SF2)为0.62,常氧细胞为0.43,提示乏氧A549细胞放射敏感性降低.常氧下A549细胞HIF-1α和beclin1蛋白低表达,乏氧12、24、48 h时间点HIF-1α和beclin1蛋白表达明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).相应时间点HIF-1α与beclin1的表达呈正相关(r＝0.75,P＜0.05).A549/HIF-1α-shRNA的SF2为0.45,放射增益比(SER)为0.72,明显低于阴性对照组,说明抑制HIF-1α表达明显提高乏氧A549细胞放射敏感性.乏氧条件下HIF-1α的表达被抑制后 beclin1 蛋白的表达明显降低(24 h:t=5.69,P=0.01;48 h:t=5.13,P=0.01).结论 乏氧诱导的自噬参与肺腺癌的放射抵抗.     

低氧诱导因子促内皮祖细胞活性的可行性研究

目的探讨在体外低氧诱导因子-1α(HIF-1α)促血管内皮祖细胞(EPCs)成血管活性的可行性.方法密度梯度法分离人外周血EPCs,电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPCs,RT-PCR法观察未转染/转染质粒在转染后3、12、20、72 h,HIF-1α及下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达含量的变化;免疫组化法检测常氧中转染前后HIF-1α蛋白表达、VEGF受体Flk-1蛋白表达在不同组质粒转染后的差异;ELISA法测定各组质粒转染后VEGF在培养基上清中释放含量及VEGF依赖性一氧化氮合成酶(eNOS)含量的改变.结果HIF-1α基因有效转染入EPCs;HIF-1αmRNA在未转染时即有表达,在HIF-1α质粒转染后3、12、20、72 h,含量较未转染时增加(P＜0.05);HIF-1α过表达诱导VEGF表达上调(P＜0.05).Flk-1蛋白在常氧下有一定含量,在HIF-1α质粒转染后Flk-1蛋白表达进一步增加.VEGF释放含量在HIF-1α过表达组显著增加(P＜0.05);HIF-1α诱导eNOS含量增加,并与时间、VEGF刺激量成正比.结论HIF-1α质粒在体外能有效的转染入EPCs,促进其下游靶基因及受体表达,引起相应的功能学改变,促EPCs向内皮细胞分化、扩增,可进一步应用于基因治疗.     

VEGF基因转染结合脱蛋白骨修复股骨头坏死的实验研究

目的:构建pcDNA3.1/VEGF165质粒及联合脱蛋白骨基因治疗早期股骨头缺血性坏死.方法:将含人VEGF165全长cDNA序列的克隆载体pUC18/VEGF165与pcDNA3.1( )载体构建成重组真核表达质粒pcDNA3.1/VEGF165;69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组.第一组,将脱蛋白骨复合pcDNA3.1/VEGF165质粒植入坏死的股骨头内;第二组植入DPB;第三组仅在股骨头内钻一隧道.股骨头标本术后3天,1,2,4,8和16周获取.RT-PCR检测VEGF165mRNA的表达,Western blot检测VEGF165蛋白的表达,组织形态学分析血管发生和股骨头修复.结果:成功构建pcDNA3.1/VEGF165;第一组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周.血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异呈显著性(P＜0.01).结论:VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成.脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础.     

shRNA干扰肾癌细胞株786-O和OS-RC-2中HIF-2α的表达对VEGF的影响

目的构建在哺乳动物细胞中表达的低氧诱导因子-2(HIF-2α)的短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,在体外模拟肿瘤常氧和低氧环境下研究对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。探讨HIF-2α、VEGF两者之间及其与肾透明细胞癌(CCRCC)的关系,HIF-2α可能为CCRCC潜在的新效靶。方法构建HIF-2α shRNA真核表达载体质粒, shRNA测序鉴定。150 umol/L氯化钴(Co Cl2)模拟细胞低氧环境。设对照组(空白、阴性)和实验组。空白对照组不做转染,阴性对照组转染空质粒,实验组转染HIF-2α shRNA重组质粒,每组均设置常氧和低氧环境组。采用Real time-PCR技术检测786-O和OS-RC-2细胞中HIF-2α基因表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测VEGF蛋白表达情况。结果 DNA测序证实重组质粒构建成功, shRNA转染786-O和OS-RC-2细胞,实验组中HIF-2α mRNA表达明显受到抑制,且常氧较低氧环境下HIF-2α mRNA表达降低,低氧环境下凋亡显著;常氧和低氧环境下,实验组VEGF蛋白表达量均下降,且常氧环境下蛋白表达下降明显。结论低氧环境下,HIF-2α mRNA表达量升高,促进VEGF蛋白表达。干扰HIF-2α基因后,细胞凋亡率升高,抑制VEGF蛋白表达。该基因可能为治疗CCRCC提供了新的效靶,为下一步实验鉴定奠定基础。     

化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210的表达

目的探讨不同浓度CoCl2对人肝癌细胞SMMC-7721乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）和miR-210表达的影响以及RNA干扰HIF-1α基因对miR-210表达的影响。方法采用Western blot法检测不同浓度CoCl2培养24 h后SMMC-7721细胞HIF-1α蛋白表达变化,实时定量PCR检测miR-210相对表达量。脂质体介导靶向HIF-1α基因的RNA干扰质粒pGenesil-HIF转染SMMC-7721细胞后,乏氧培养24、48和72 h,分别采用Western blot法和实时定量PCR检测细胞HIF-1α蛋白表达变化和miR-210相对表达量。结果 50和100μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量与0μmol/L组相比,差异均无统计学意义（均P〉0.05）;150和200μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量均显著高于0μmol/L组（P〈0.05或P〈0.01）。转染质粒pGenesil-HIF后乏氧培养24、48和72 h,细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量显著低于阴性干扰组（均P〈0.01）。结论化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210表达明显上调,RNA干扰HIF-1α基因可明显下调乏氧细胞miR-210表达。     

含hNIS报告基因的乏氧调控重组质粒的构建及其功能鉴定

目的构建乏氧应答启动子调控的人钠/碘共同转运体（hNIS）报告基因重组质粒,为实体瘤微环境乏氧的实时监测提供研究基础。方法合成乏氧反应元件（HRE）的核苷酸片段,克隆入pGL3-promoter,构建为pGL3-promoter-5×HRE载体。然后将扩增的hNIS基因插入pGL3-promoter-5×HRE载体中,构建为pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒并进行测序验证。以DMSO处理组作为对照,CoCl_2处理HEK293细胞模拟乏氧;将经验证的pShuttle-NIS质粒转染HEK293乏氧细胞,同时将构建的pcDNA3.1-HIF-1α质粒和pShuttle-NIS质粒按照3：1比例转染HEK293细胞,转染空质粒pcDNA3.1和pShuttle-NIS质粒组作为对照。通过qRT-PCR法检测hNIS基因表达的变化。并用高锝酸盐（~（99m）TcO_4~-）处理双质粒共转染的HEK293细胞,洗脱游离~（99m）TcO_4~-后通过γ计数器采集细胞放射性计数,检测所表达NIS蛋白的功能。结果克隆的基因产物与预期一致,序列无碱基的突变。共转染HIF-1α质粒组及转染pShuttle-NIS的CoCl_2处理组,其hNIS mRNA的表达量显著高于转染空质粒及DMSO处理组（均P〈0.01）。共转染HIF-1α质粒组细胞的~（99）TcO_4~-摄取率显著高于空质粒对照组（P〈0.01）。结论 pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒转染后能介导细胞摄取~（99m）TcO_4~-,为微环境细胞乏氧的核素显像提供实验依据。     

高糖对AhR及其血管生成相关因子表达的影响

目的探讨高浓度葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老模型中芳香烃受体(AhR)的变化及其对血管生成相关因子表达的影响。方法采用高浓度葡萄糖溶液(33 mmol/L)处理HUVECs诱导内皮细胞衰老,通过β-半乳糖苷酶染色观察细胞衰老情况,Western blot检测HUVECs中AhR蛋白以及血管生成相关因子低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达,ELISA检测细胞培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化,Matrigel小管生成实验评估小管生成能力,Transwell检测细胞迁移能力。结果与对照组相比,高糖组AhR蛋白表达显著上升,而HIF-1α蛋白表达则显著降低,差异有统计学意义(P0.05);与对照组相比,高糖组的VEGF蛋白含量表达和NO浓度均显著降低,差异均有统计学意义(P0.05);高糖组平均小管生成长度和细胞迁移数均较对照组显著减少(P0.05)。结论在高浓度葡萄糖下培养的HUVECs中AhR蛋白表达明显增加,HIF-1α和VEGF等促血管生成因子明显减少。