RNA干扰乳腺癌MCF-7细胞HSPA8基因表达

目的：构建并筛选高干扰率的热休克蛋白8（HSPA8）(相对分子质量70 000)基因干扰质粒,为进一步研究HSPA8基因在乳腺癌中的作用提供材料。方法：根据GenBank所发表的HSPA8的基因序列合成4个干扰片段,依次构建1、2、3和4组干扰质粒：pGPU6/GFP/Neo-349、pGPU6/GFP/Neo-818、 pGPU6/GFP/Neo-931和pGPU6/GFP/Neo-1180,将这4组干扰质粒分别转染至人乳腺癌MCF-7细胞,并设阴性及空白对照组。经过G418筛选后得到稳定转染的细胞株,采用RT-PCR 和Western blotting方法分别从mRNA 和蛋白质水平检测各组干扰质粒对HSPA8基因的干扰效果。结果：RT-PCR检测转染shRNA干扰质粒的各组MCF-7细胞的HSPA8基因mRNA转录水平与未转染组比较,干扰质粒1组HSPA8基因的表达量下降了25.0%,干扰质粒2组下降了37.5%,干扰质粒3组下降了43.7%,干扰质粒4组下降了68.5%。Westen-blotting检测结果显示：各实验组与对照组之间蛋白表达比较差异有显著性（P<0.05）,pGPU6/GFP/Neo-1180干扰质粒的干扰效率最高。结论： 成功构建了HSPA8基因的干扰质粒,提示HSPA8基因及其表达产物为研究HSPA8基因在乳腺癌的发生、发展中的作用提供了材料。     

乙型肝炎病毒X蛋白促进肝癌细胞株生长及其分子机制的实验研究

目的:研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝癌细胞株中增殖分子、侵袭分子、血管新生分子表达的影响。方法:培养肝癌细胞株HepG2并分为HBx组和对照组,分别转染pcDNA3.1-HBx质粒以及空白的pcDNA3.1质粒。转染后24h和48h,检测细胞中增殖分子Survivin、cyclinD1、c-myc以及侵袭分子CD44v6、MT1-MMP、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP7以及血管新生分子血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管生成素(Ang)-1、Ang-2、成纤维细胞生长因子(FGF-2)的mRNA表达量。结果:转染24、48h后,HBx组细胞中Survivin、cyclinD1、c-myc、CD44v6、MT1-MMP、MMP2、MMP7、VEGF、Ang-1、Ang-2、FGF-2的mRNA表达量均显著高于对照组(P<0.05)。结论:HBx能够促进肝癌细胞株中增殖分子、侵袭分子、血管新生分子的表达。     

VEGF基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建干扰血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因RNA表达的重组质粒。方法设计3组针对VEGF基因的核糖核酸干扰（RNA interference,RNAi）序列,应用基因重组技术克隆入载体pcDNA3.1中,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,用DNA直接测序法和双酶切法鉴定构建的重组质粒。结果 DNA测序证实克隆入载体pcDNA3.1（-）中的序列正确,双酶切证实RNA干扰序列正确插入载体pcDNA3.1（-）。结论成功构建针对VEGF基因的RNAi质粒,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定了基础。     

人低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人HIF1α腺病毒表达载体,研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用。方法采用分子克隆技术,从pcDNA3.1/V5-HisA-HIF1α质粒获得HIF1αcDNA,经pcDNA3.1(+)克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组穿梭质粒,含有HIF1αcDNA的表达盒通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-XViralDNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×109pfu/mL。结论成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α,为冠心病的基因治疗研究奠定基础。     

RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响

目的:探讨中RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响,阐明其作用机制。方法:构建靶向基因YWHAZ的siRNA载体重组质粒pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612和pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505作为RNA干扰质粒组,同时设立阴性对照质粒组(pGPU6/GFP/Neo-shNC质粒);采用荧光定量PCR检测YWHAZ mRNA的表达水平和表达抑制率;采用MTT法检测HCT-8细胞的增殖率。结果:倒置荧光显微镜下观察,细胞转染率为60%。荧光定量PCR检测,RNA干扰组YWHAZ mRNA表达水平低于阴性对照组(P<0.01),平均抑制率为52.86%。MTT检测,与阴性对照组比较,RNA干扰质粒组细胞增殖率明显降低(P<0.01),平均细胞增殖率为68.75%。结论:干扰YWHAZ可抑制该基因的转录,并抑制HCT-8细胞的增殖。     

pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒的构建及其在体外人脐静脉内皮细胞中抑制Ang2.Tie2基因的表达

目的 探讨应用RNA干扰(RNAi)技术抑制Ang2、Tie2基因的表达情况,为进一步研究其在体外抑制血管生成以及抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础.方法 构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条并予以鉴定.用pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测各组HUVECs中Ang2及Tie2的蛋白及mRNA的表达状况.结果 成功构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条,用其转染HUVECs后,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,Ang2、Tie2在蛋白和mRNA的表达水平均受到明显抑制(P＜0.05),并且siRNA的2条重组质粒之间均差异无统计学意义(P＞0.05).结论 pSilencer 1.0-u6-Ang2/Tie2-siRNA在体外能够抑制HUVECs的Ang2和Tie2的蛋白及mRNA的表达.     

SAA 对鼻咽癌 CNE2细胞生物学行为的影响

目的：观察血清淀粉样蛋白 A（SAA）的超表达和抑制表达对鼻咽癌 CNE2细胞生物学行为的影响。方法体外培养 SAA 高表达的 pcDNA3．1（＋）-SAA-CNE2细胞系和干扰 SAA 表达的 pGPU6／GFP／Neo-SAA-CNE2细胞系,两种细胞由课题组前期重组的 SAA 高表达 pcDNA3．1（＋）-SAA 质粒及抑制 SAA 表达的 pGPU6／GFP／Neo-SAA 质粒分别转染构建。流式细胞仪分析以上两种细胞的细胞周期。平皿克隆实验检测细胞的增殖状况。结果流式细胞仪检测细胞周期显示 SAA 表达的增多可促进 CNE2细胞分裂。平皿克隆实验显示 SAA 可使 CEN2细胞的增殖能力增强。结论 SAA 具有促进人鼻咽癌 CNE2细胞增殖和体外迁移浸润的作用。     

NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立

目的 构建N-myc下游调节基因1（NDRG1）的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞（hCMECs）后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。 方法 将pGPU6-GFP质粒采用BamH Ⅰ和Bbs Ⅰ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体,经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs,采用荧光显微镜观察载体转染效率,将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接,经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体,采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平,Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平,采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs。 结果 pGPU6-GFP载体经双酶切后,电泳结果显示完全线性化,测序结果显示shRNA均成功连接至pGPU6-GFP载体;荧光显微镜观察载体转染效率约为70%;RT-qPCR法检测,有3个shRNA干扰载体的干扰效果良好,转染后hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平分别约为对照组的26%、21%和13%;Western blotting法检测到对应的特异性蛋白条带,重组质粒pcDNA3.1-NDRG1经双酶切后,电泳结果可见大小为1 185和5 428 bp的2条DNA条带,测序结果显示NDRG1基因成功插入,成功制备阳性克隆hCMECs。RT-qPCR法检测,阳性克隆hCMEC中NDRG1 mRNA表达水平较对照组升高,约为对照组的25.96倍;Western blotting法检测,hCMEC中NDRG1蛋白表达水平较对照组升高。 结论 成功构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体并验证干扰效果;成功构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体和稳定过表达NDRG1的hCMECs。     

人低氧诱导因子1-α转染人骨髓内皮祖细胞的体外实验

目的：将人低氧诱导因子1-α（HIF1-α）转染人骨髓内皮祖细胞(EPCs),为探讨转染HIF1-α基因的EPCs对梗塞心肌血管修复及血管再生能力提供依据。方法：密度梯度法分离人骨髓中单个核细胞,以1×10⁶•mL^-1细胞浓度接种于用纤维连接蛋白包被的培养皿中,培养14 d后采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性成分ecNOS、flk- 1的表达;采用acLDL-Dil和FITC-UEA-1对细胞染色;采用Lipofectamine^TM 2000介导PCDNA3.0-HIF1-α质粒转染EPCs, RT-PCR检测HIF1-α的转录; ELISA检测细胞上清中VEGF表达;免疫印迹法检测HIF1-α蛋白表达。结果：培养第5天起,部分圆形单核细胞转化为梭形贴壁EPCs,7 d左右出现由数十个细胞形成的细胞集落, 10 d后形成明显克隆。RT-PCR检测ecNOS在548 bp处出现条带,flk-1在819 bp处出现条带;acLDL-Dil和FITC-UEA-1双染色阳性;RT-PCR在383 bp处出现特异性条带;ELISA转染HIF1-α的EPCs上清中VEGF含量为（20.53±2.33） μg•L^-1,未转染HIF1-α的EPCs上清中VEGF含量为（3.96±1.67） μg•L^-1,两组比较差异有显著性（P<0.05）。免疫印迹法(Western blotting)检测在相对分子质量120 000处出现条带。结论：PCDNA3.0-HIF1-α质粒成功转染EPCs。     

RNA干扰PTEN基因对HCT-8 细胞增殖能力的影响

 目的:观察小干扰RNA (siRNA)对结肠癌相关基因PTEN表达的抑制作用及其对结肠癌细胞增殖能力的影响。方法：构建携带有针对PTEN基因序列的siRNA真核绿色荧光表达载体重组质粒pGPU6/GFP/Neo-PTEN-1、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-2、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-3和pGPU6/GFP/Neo-PTEN-4,脂质体法转染入结肠癌HCT-8细胞(分别为p1、p2、p3和p4组),同时设转染阴性对照质粒组(p5组)和亲本细胞组(p6组),实时 PCR方法检测PTEN mRNA表达,MTT法分析细胞增殖活性变化。结果：通过荧光显微镜观察计数,细胞转染率为58%。实时PCR方法检测结果显示,siRNA 重组质粒pGPU6/GFP/Neo-PTEN-1、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-2、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-3和pGPU6/GFP/Neo-PTEN-4的抑制率分别为48.3%、76.5%、29.4%和61.2%,与p6组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。MTT结果表明,细胞增殖抑制能力明显增强。结论：PTEN基因在肿瘤的发生发展中可能起到一定的作用。     

c-myc通过提高结肠癌细胞LoVo的HIF-1α表达促进血管生成

目的 研究癌基因c-myc对人结肠癌细胞LoVo中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响及其对血管生成的作用.方法 构建高表达c-myc的质粒pcDNA3.1-c-myc;将构建好的pcDNA3.1-c-myc质粒转染入LoVo细胞系中,通过Western blot检测c-myc在LoVo细胞中的表达情况.应用real-time PCR和Western blot检测常氧和乏氧状态下LoVo细胞系中HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA水平及HIF-1α的蛋白水平.应用条件培养液培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察其形成血管的能力.结果 成功构建pcDNA3.1-c-myc质粒;常氧、乏氧状态下转染pcD-NA3.1-c-myc质粒后,LoVo细胞系中HIF-1α的mRNA水平无变化,VEGF的mRNA水平明显升高,HIF-1α蛋白水平明显增高.高表达c-myc的LoVo细胞上清液培养HUVECs细胞后能增强其成管能力.结论 在LoVo细胞系中高表达c-myc,可以促进细胞HIF-1α和其下游的VEGF表达,从而促进血管生成.     

UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响

目的 利用RNAi技术同时沉默Ⅱ型单纯疱疹病毒的UL54和UL29基因,探讨双基因干扰对HSV-2复制的影响.方法 采用pGPU6/GFP/Neo质粒分别构建UL54、UL29基因的shRNA重组表达质粒,单独或同时转染HEK293细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测UL54、UL29基因的表达,终点滴定法检测培养细胞上清液中病毒感染滴度;MTT法测定细胞的存活效率.结果 转染后48h后,与空白组相比,各干扰组均可不同程度降低上清液中的病毒滴度,提高细胞存活率,降低目的基因mRNA和蛋白的表达（P＜0.01）.与单干扰组相比,双基因干扰组能更有效降低病毒滴度并提高细胞存活率（P＜0.01）,增加了对UL54和UL29基因mRNA的抑制率,降低了蛋白的表达（P＜0.01）.结论 pG-PU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达质粒同时转染细胞可抑制HSV-2的复制,采用双基因干扰比单独基因干扰具有更高的效率.     

人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2 基因shRNA载体的鉴定和表达

目的构建针对人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2(AMPKα2)基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体,转染SH-SY5Y细胞株,观测其对AMPKα2基因的沉默效果。方法利用Ambion在线设计软件设计针对人AMPKα2基因的shRNA干扰序列,克隆到pGPU6/GFP/Neo质粒载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用质脂体将重组质粒转导SH-SY5Y细胞株,经G418筛选阳性克隆后用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达水平。结果经DNA测序和酶切鉴定表明,4个shRNA表达载体构建成功。4个重组质粒之一的pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2(3)能有效抑制AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞株中的表达,抑制率为63%。结论成功构建了针对人AMPKα2基因的shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2。pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2(3)能有效抑制AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞株中的表达,为将来应用其研究AMPK在细胞损伤中的作用奠定了基础。     

人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)中的表达。方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列。用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析。结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确。经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞。结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达。     

KLF2过表达及敲减胃癌稳转细胞株的建立

目的 构建KLF2过表达BGC823和KLF2敲减MGC803胃癌稳转细胞株。方法克隆人源KLF2基因,连接到AgeI/AgeI酶切后GV358载体上,构建GV358-KLF2重组质粒,转染293T细胞,包装慢病毒;构建KLF2shRNA,连接到BamHI和EcoRI双酶切后的PHBLV-U6-ZSGreen-Puro载体上,经鉴定后转染293T细胞。采用RT-PCR及Western印迹法检测稳转细胞株中KLF2的表达。结果利用慢病毒介导,重组质粒GV358-KLF2和KLF2-shRNA转导入BGC823细胞、MGC803细胞并稳定表达。RT-PCR和Western印迹法结果均显示过表达稳转株KLF2表达量明显升高（P＜0.05）,敲减稳转株KLF2表达量明显下降（P＜0.05）。结论成功构建了KLF2过表达BGC823细胞株和KLF2敲减MGC803细胞株,为后续KLF2功能实验奠定了基础。     

氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响

目的 对已构建的突变型人低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala(单突变)和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala(双突变)进行进一步的功能鉴定.方法 将pcDNA3.1+/HIF-1α、pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala分别用脂质体法短暂转染人胚肾上皮细胞(human embryo kidney 293,HEK293);Western blotting法检测正常氧、低氧无钙离子或有钙离子条件下各组转染细胞HIF-1α蛋白水平:RT-PCR法检测正常氧条件各组转染细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达.结果 正常氧条件下,转染突变体的细胞较转染野生型HIF-1α载体的细胞HIF-1α蛋白和VEGFmRNA水平增高;低氧条件下,转染野生型HIF-1α载体的HEK293细胞HIF-1α蛋白水平增高:Ca~(2+)刺激减少低氧时转染野生型HIF-1α载体细胞HIF-1α蛋白水平,但对转染突变体细胞HIF-1α蛋白水平无明显影响.结论 pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala两种突变体产物在蛋白水平上具耐氧和耐蛋白酶降解的特性.

Abstract：

Objective To study the effects of oxygen and calcium on the expression of eukaryotic vectors harboring wild-type or mutated hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in HEK293 cells.Methods HEK293 cells were transiently transfected with pcDNA3.1+/HIF-1α,pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala via lipofectin.Western blotting were used to detect HIF-1α protein after normoxic or hypoxic exposure of the transfected HEK293 cells in the presence or absence of Ca~(2+).The levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA in the transfected cells in normoxic condition was detected using RT-PCR.Results The levels of HIF-1α protein and VEGF mRNA increased in HEK293 cells transfected with the vectors harboring mutated HIF-1α, but not in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors in normoxia.Hyooxia increased the levels of HIF-1α protein in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors,which was inhibited by the application of Ca~(2+). Ca~(2+) showed no inhibitory effect on HIF-1α levels in HEK293 cells transfected with the vectors containing mutated HIF-1α. Conclusion The protein products of pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala in HEK293 cells enhance the cell tolerance to oxygen and protease.     

VEGF基因转染结合脱蛋白骨修复股骨头坏死的实验研究

目的:构建pcDNA3.1/VEGF165质粒及联合脱蛋白骨基因治疗早期股骨头缺血性坏死.方法:将含人VEGF165全长cDNA序列的克隆载体pUC18/VEGF165与pcDNA3.1( )载体构建成重组真核表达质粒pcDNA3.1/VEGF165;69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组.第一组,将脱蛋白骨复合pcDNA3.1/VEGF165质粒植入坏死的股骨头内;第二组植入DPB;第三组仅在股骨头内钻一隧道.股骨头标本术后3天,1,2,4,8和16周获取.RT-PCR检测VEGF165mRNA的表达,Western blot检测VEGF165蛋白的表达,组织形态学分析血管发生和股骨头修复.结果:成功构建pcDNA3.1/VEGF165;第一组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周.血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异呈显著性(P＜0.01).结论:VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成.脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础.     

HIF-1对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用。方法将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染入SiHa细胞中,分别命名为fLHIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组。应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测。应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。结果免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下,fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pcDNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

缺氧诱导因子及其抑制因子调控肾癌细胞生长的实验研究

目的 检测缺氧诱导因子抑制因子（FIH-1）在肾癌细胞中的基因和蛋白表达情况,以进一步了解FIH-1对肾癌细胞生长调控的机制。方法 选取人肾癌细胞株786-0及OS-RC-2,运用real-time PCR（RT-PCR）和Western blot方法检测细胞株中FIH-1、缺氧诱导因子1α（HIF- 1α）、 缺氧诱导因子2α（HIF- 2α）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。并人工构建FIH-1过表达质粒,将其转入上述的两种细胞株中,运用RT-PCR和Western blot方法观察转染后FIH-1、HIF及VEGF的表达情况;同时运用MTT方法分析转染后两种肿瘤细胞的增殖情况。结果 RT-PCR和Western blot检测结果都显示,786-0和OS-RC-2细胞中都能检测到FIH-1和VEGF的表达;OS-RC-2细胞中同时存在HIF-1α和HIF-2α表达,而786-0细胞中只有HIF-2α的表达;786-0细胞中FIH-1表达比OS-RC-2细胞高,VEGF的表达比OS-RC-2低; 转染FIH-1过表达质粒后,OS-RC-2细胞内的FIH-1表达量明显升高,下游蛋白HIF-1α的表达量降低,VEGF的表达量也降低,而HIF-2α的表达量前后不变;在786-0细胞内的FIH-1表达量明显升高时,HIF-2α的表达量不变,VEGF的表达量也不变。在OS-RC-2细胞中,转染FIH-1过表达质粒后细胞的增殖变缓,而786-0细胞的增殖则没有明显的变化。结论 在肾癌细胞中存在FIH-1/HIF-1α/VEGF信号通路,FIH-1反向调节HIF-1α的表达,HIF-1α正向调节VEGF的表达。在HIF-1α及HIF-2α都存在时,FIH-1可通过对HIF-1α调控影响HIF-1α下游基因表达,抑制肾癌细胞的增殖。