真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

人IL—18结合蛋白cDNA的克隆及其逆转录病毒载体的构建

目的：克隆人白细胞介素－18结合蛋白（hIL-18BP)的cDNA及构建hIL-18BP逆转录病毒载体,以研究IL－18BP与IL－18相互作用的机制及自身免疫性疾病的基因治疗。方法：从中国汉族人胎盘组织中提取总RNA,用RT－PCR方法扩增hIL-18BP cDNA,与载体pcDNA3连接,转化大肠杆菌DH5α,得到的重组质粒经鉴定正确后,再作为模板进行PCR,PCR产物插入逆转录病毒载体pLNCX中。结果RT－PCR扩增出全长585bp hIL-18BP cDNA,2次酶切鉴定证明hIL-18BP已分别与pcDNA3,pLNCX重组,2次测序结果均与国外文献报道的hIL-18BP的序列一致。结论：成功地克隆了中国人IL－18BP cDNA,并构建了重组hIL-18BP 闻转录病毒载体。     

NP、HN、F基因重组质粒治疗人喉癌裸鼠模型的实验研究

目的：寻找理想的基因治疗喉癌的新方法。方法：采用通过RT－PCR方法及基因重组技术，将新城疫病毒的NP、NH、F基因克隆于真核表达质粒pcDNA3中。将pcDNA3－NP、pcDNA3－结构观察，裸鼠各种组织进行PCR检测，裸鼠血清进行ELISA实验，探讨其作用机理及安全性。结果：在实验组与对照组之间，鼠重，瘤重，瘤体积经统计学处理均有显差异。光镜及电镜下可见肿瘤细胞的坏死与凋亡及炎性细胞浸润。PCR检测：各种组织中均未检测到NP基因，ELISA实验：实验组为阳性，结论：pcDNA3－NH、pcDNA3－F具有抗肿瘤作用，其机理是pcDNA3－NP、pcDNA3－HN、pcDNA3－F能够引起Hep-ll肿瘤细胞的直接溶解。能够增加肿瘤的免疫原性，参诱导产生多种细胞因子。pcDNA3－NP、pcDNA3－HN、pcDNA3－F对正常组织细胞无损害。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能，构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列，亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1，脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞，采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2，并成功转染入SHG-44细胞，为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。     

构建单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因真核表达载体

从单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞培养液和细胞裂解液中提取HSV－Ⅱ基因组DNSA，以此为模板，用PCR方法获取胸苷激酶（TK）基因，将获取的DNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3中，筛选阳性克隆测序，结果表明：本研究获取的HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，编码376个氨基酸，结果表明：本研究扩增出HSV－ⅡTK基因的全部编码区序列，并成功构建真核表达载体pcDNA3／TK.     

T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因蛋白表达

目的：检测T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗的基因表达。方法：大剂量提取质粒，将BALB／c鼠随机分为pcDNA3．1组、pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组和全硫代CpG组共5组（每组6只），双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。接种疫苗后5d，用RT－PCR法检测重组质粒mRNA表达。接种疫苗后7d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达。结果：pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRβ8＋CpG＋脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达，而pcDNA3．1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达。结论：T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物。     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

从妊娠人胎盘绒毛组织克隆HLA—G1 cDNA

为系统研究HLA－G1人子的生物学功能，采用RT－PCR技术，从人流的胎盘绒毛组织中提取总PNA，经过逆转录合成HLA－G1的全长cDNA,插入到真核表达载体pcDNA3中，构建重组表达质粒pcDNA3-HLA-G1，转化大肠杆菌DH5a，筛选其阳性克隆株，经酶切，PCR及测序鉴定，证实HLA－G1分子的重组真核表达载体已构建成功。     

TCR Vβ8+IL-2/pcDNA3.1亚克隆重组质粒的构建

目的：构建TCRVβ8＋IL－2／pcDNA3．1亚克隆重组质粒。方法：先将TCRVβ8克隆入克隆载体pUC19，分别酶切IL－2pUC19和TCRVβ／pUC19，将IL－2连接到TCRVβ8／pUC19重组质粒上，然后将TCRVβ8＋IL－2基因从TCRVβ8＋IL－2／pUC19重组质上酶切下，克隆入pcDNA3．1表达载体上。结果和结论：经测序正实成功地构建了TCRVβ8＋IL－2/pcDNA3．1亚克隆重组质粒。     

乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体的构建

目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒pGEM-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ),构建成pcDNA3.1-HSP70重组质粒,然后,再用PCR方法,从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并克隆到质粒pcDNA3.1-HSP70,将HBsAg基因的C端与HSP70基因N端连接,构建HBsAg和HSP70融合表达质粒pcDNA3。1－SHSP70,结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确,结论：乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体构建成功。     

部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，转染细胞后检测报告基因对rhBMP-2的反应，以期用于rhBMP活性的定量测定。方法 用PCR方法扩增骨钙素部分启动子147bp，克隆入pGEM-3zf(-)中，经酶切鉴定和序列分析正确后，亚克隆人能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体pcDNA3-Luc中，构建真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，然后分别将pcDNA3-Luc和pcDNA3-OCP-Luc转染细胞，并检测其对rhBMP-2的反应。结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3-Luc大为降低，而且报告基因的表达与rhBMP-2剂量在一定范围内成线性正相关。结论 真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc的报告基因表达具有特异性，可代替直接测定骨钙素用于rhBMP-2活性的定量测定研究。     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

嗜肺军团菌mip基因真核表达重组质粒构建与表达

目的构建嗜肺军团菌m ip基因的真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip,并研究其在细胞中的表达。方法PCR扩增嗜肺军团菌m ip基因,导入载体pcDNA 3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip。用脂质体法将重组质粒pcDNA 3.1-m ip转染N IH 3T 3细胞,采用免疫荧光法和W estern-b lot分别鉴定pcDNA 3.1-m ip的瞬时表达产物和稳定表达产物。结果在细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA 3.1-m ip成功转入N IH 3T 3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA 3.1-m ip稳定转染的N IH 3T 3细胞,在相对分子质量24×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA 3.1-m ip在细胞内表达出M ip蛋白。空质粒pcDNA 3.1( )转染的N IH 3T 3细胞未检测到绿色荧光和杂交信号。结论成功构建m ip基因真核表达重组质粒,并在N IH 3T 3细胞中表达出相对分子质量为24×103的M ip蛋白。     

SUMO-2/3与孕激素受体的共价结合及其对该受体转录活性的调节

目的研究B型孕激素受体(progesterone receptor B type;PRB)是否能被SUMO-2、SUMO-3类泛素化修饰,并探讨这种修饰对孕激素受体转录活性的影响。方法以人的MCF-7 cDNA为模板进行PCR反应,扩增出SUMO-2、SUMO-3的cDNA,构建真核表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;将质粒pXJ40-myc-PRB分别与pcDNA3-FLAG、pcDNA3FLAG-SUMO2、pcDNA3FLAG-SUMO3共转染人胚肾细胞293T,运用免疫共沉淀及western印迹的方法检测其是否发生类泛素化修饰;运用测定荧光素酶报告基因的方法检测类泛素化修饰对孕激素受体转录活性的影响。结果构建成功表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;免疫共沉淀实验证实sumo2/3均可以与PRB共价结合;SUMO-2、SUMO-3能以孕激素依赖的方式增强PRB的转录活性。结论 SUMO-2、SUMO-3分子能够对孕激素受体PRB进行类泛素化修饰,并调节其分子功能。     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

诱导型一氧化氮合酶基因在3T3成纤维细胞中的转染和意义

目的观察人诱导型一氧化氮合酶基因(iNOS)转染3T3成纤维细胞的可能性.方法用阳性脂质体将含人诱导型一氧化氮的真核表达载体pcDNA3.0-iNOS转染至3T3细胞,用G418筛选,通过RT-PCR、免疫组化的方法鉴定.结果 pcDNA3.0-iNOS基因转染的3T3细胞有人iNOS基因mRNA的表达,细胞中有iNOS蛋白的表达,空载体和对照组没有表达.结论人iNOS基因能够在3T3成纤维细胞得到稳定转染和表达.     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

趋化因子IP10抑制乳腺癌细胞4T1播散转移的研究

目的观察增强IP10在肿瘤局部的表达对乳腺癌细胞4T1远端播散转移的作用。方法用电转染的方法建立稳定表达IP10的4T1细胞株IP10-4T1。将BALB/c小鼠分为IP10-4T1细胞组、4T1细胞组和转染pcDNA3的4T1细胞组(pcDNA3-4T1)。利用实验性肺转移模型和体外杀伤实验研究接种IP10-4T1对4T1细胞播散转移的影响。结果IP10-4T1细胞中IP10mRNA转录水平相对含量为0.92±0.12与未转染的4T1细胞(0.35±0.12)和pcDNA3-4T1细胞(0.29±0.08)比较差异有统计学意义(P<0.01)。IP10-4T1组对淋巴细胞的趋化指数为2.77±0.29,经CXCR3抗体处理后下降为1.71±0.20(P<0.05)。实验性肺转移结果显示,IP10-4T1组小鼠肺重为0.27g±0.02g,与4T1细胞组(0.48g±0.08g)和pcDNA3-4T1组(0.43g±0.16g)比较明显减轻(P=0.021);其肺表面形成的转移结节数较对照组少;IP10-4T1组肺组织中形成的4T1细胞克隆数为2.6±1.7,明显低于4T1组(34.0±6.3)和pcDNA3-4T1组(33.0±2.3,P<0.05);2/6的IP10-4T1组小鼠肺组织内可见转移灶,而对照组全部形成肺转移灶。接种IP10-4T1细胞组小鼠的淋巴细胞杀伤率在各个效/靶比均高于对照组(P<0.05)。结论增加肿瘤局部IP10的表达,能增强机体细胞免疫应答水平,通过肿瘤特异性的杀伤作用,抑制肿瘤细胞在体内播散转移。