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目的 构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I重组表达载体,为进一步研究DJ-1M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1M26I质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平鉴定.结果 pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1 M26I质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,经PCR检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1 M26I基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-his-DJ-1和pcDNA3.1/myc-his-DJ-1 M26I重组表达质载体. 相似文献
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目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡. 相似文献
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目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的. 相似文献
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