两种大肠杆菌表达融合蛋白的纯化

0　引言　利用原核生物来表达外源蛋白是一种简便高效的获取重组产物的方法 .但是 ,重组蛋白在大肠杆菌中往往形成不溶解的无活性的包涵体 ,仅有少量产物以溶解状态存在 .我们通过两种不同的纯化方式 ,对如何获得有活性的蛋白表达产物进行初步的探讨 .1　材料和方法1.1　材料　融合表达质粒 p JL c II ras和 p GEX- 4 T- m cp分别由陈苏民教授和王字玲博士惠赠 .大肠杆菌菌株 TAP10 6和JM10 9及 GST亲和层析柱 ,Sepharose 4 B层析柱和其他生化制剂均由本校生化教研室提供 .1.2　方法　将质粒 p JL c II ras,p GEX- 4 T- mcp分别…     

不同剪切形式的小鼠Era对L-929细胞的影响

目的: 构建两种完全可调控诱导不同剪接形式小鼠era的真核表达载体,检测不同剪接形式的鼠Era蛋白对细胞生长状态的影响.方法: 构建两种不同剪接形式鼠era的完全可调控诱导表达载体,分别与受体表达载体pERV3稳定共转染鼠成纤维细胞系L-929.用PonA进行诱导表达后,以Western Blotting检测Era蛋白表达水平,以MTT法测定细胞生长曲线,以流式细胞仪检测细胞周期.结果: 成功获得稳定的可完全诱导表达两种不同剪接形式鼠Era蛋白的细胞系;经过PonA诱导后,过表达两种剪接形式Era蛋白的L-929细胞,生长速度加快,G2/M期细胞数量明显减少.结论: 两种剪接形式鼠Era蛋白在真核细胞周期中发挥重要作用.     

兔抗人ERA多克隆抗体的纯化

目的纯化兔抗人ERA的多克隆抗体。方法在大肠杆菌中,表达重组MBP-hEra融合蛋白。表达产物先继以直链淀粉树脂亲和柱和Superose12凝胶柱过滤纯化。将纯化的MBP-hEra偶联于NHS-activatedSepharoseTM上,制备亲和层析柱,纯化兔抗人ERA多克隆抗体。结果①表达、纯化的MBP-hEra,相对分子质量(Mr)为78×103,其纯度为95％。②从抗血清中纯化获得可与MBP-hEra特异性结合的兔抗hEra多克隆抗体。结论获得了特异性较好的纯化兔抗hEra多克隆抗体。     

人骨形成蛋白cDNA 1,2A和3在大肠杆菌中的克隆、表达及活性

骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,简称BMP)是一类可以诱导异位宿区间充质细胞分化成软骨和骨细胞的蛋白质,在促进骨修复中具有较高的应用价值,为了在大肠杆菌中有效地表达人BMP,我们将人BMP1,BMP2A和BMP3的cDNA分别插入表达载体中,获得预期结果。1 材料和方法 人骨形成蛋白cDNA 1,2A和3由口腔医学院杨连甲教授赠送,表达载体pBV220由张德震博士赠送,表达载体pSM43由陈苏民教授构建.人BMP1 cDNA先以“缺口双链”定位插入突变技术,将其5’端信号肽序列去掉,并引入起始密码ATG,将经改造的人BMP1 cDNA 5’端1.44     

人era的结构特点分析及其定点突变体的构建

目的：构建最近克隆的人era基因的定点突变体。方法：利用数据库对era的结构特点进行分析，在此基础上用改良的重叠延伸法分别构建人EraN端和C端的定点突变体。结果：获得了分别针对人EraN端TGP结合结构域（位于29－36氨基酸残基）和C端具有RNA结合活性的 KH结构域（位于297－340氨基酸残基）的定点突变体。结论:人era定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础。     

重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定

目的: 用基因工程手段去获取有活性的重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步的基础理论研究和临床应用奠定基础.方法: 用PCR手段获得人PF4的编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,用SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白,用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(CAM)验证rhPF4的活性.结果: 成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.CAM实验表明,经纯化获得的rhPF4对鸡胚血管形成具有抑制作用.结论: 成功地获得了具有高度生物学活性的rhPF4蛋白.     

人源性抗HBsAg噬菌体抗体的筛选及纯化

目的:获得人源性抗HBsAg抗体Fab片段。方法:用预包被HBsAg的ELISA板,从构建的人全套抗体库中筛选出针对HBsAg的噬菌体抗体。并转入大肠杆菌中表达。破裂细胞后,获得可溶性Fab片段。以羊抗人Fab抗体偶联HiTrap柱,用     

~(125)Ⅰ—cAMP放射免疫分析法

本文介绍了~(125)I-ScAMP-TME的制备方法和cAMP的放射免疫分析法。标记时所需的ScAMP-TME由碳化二亚胺法合成后用纸层析法提纯,~(125)I标记则采用氯胺T法。经降低标记时的温度和pH、缩短标记时间后,减少了标记过程中ScAMP-TME的分解产物的形式,所得~(125)I-ScAMP-TME的比放射性可达350ci/mmol。cAMP放射免疫分析法灵敏度为37fmol,标准曲线工作范围为62.5-2000fmol/管,批内变异系数为7.13％,批间变异系数为8.71％,与cGMP的交叉反应<0.0042％。     

rhBMP-2m在高浓度条件下的复性

目的:优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽(rh-BMP-2m)的复性条件.方法: 将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH,氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性.透析复性后进行非还原的SDS-PAGE,检测rhBMP-2m活性形式二聚体的含量,同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22 μm微孔滤膜除菌并计算其损失率.结果: 经透析复性后rhBMP-2m完全可溶,而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右,即复性后二聚体的rhBMP-2m可以达到每升发酵液800 mg,并且经微孔滤膜除菌后rhBMP-2m活性形式二聚体的含量基本没有损失,同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%.结论: 高pH有利于rhBMP-2m的复性,除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP-2m复性后仍保持可溶.蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大,但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大.     

新的人抗HBsAg抗体Fab cDNA的克隆及序列分析

目的 从已构建的人抗－ＨＢsAg噬菌体抗体库中筛选出结合乙肝表面抗原（ＨＢsAg)的特异的人噬菌体抗体（Ｆab段）,并进行基础序列分析。方法 对噬菌体抗全库进行三轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选,使特异性噬菌体抗体得到了富集,ＥＬＩＳＡ实验和ＥＬＩＳＡ竞争抑制实验鉴定出乙肝表面抗原的特异性抗体,同时对筛选出的克隆进行基因序列分析。结果 得到与乙肝表面抗原特异结合的抗体,并通过基因序列分析证明为抗乙肝ＨＢsAg的抗休天经地义人得到的抗惭肝ＨＢ－sAg的特异抗体为下一步表达纯化工作奠定了基础。