FNDC1在肺腺癌中高表达并与不良预后相关

目的 研究Ⅲ型纤连蛋白结构域1（FNDC1）蛋白在肺腺癌组织中的表达及临床意义。 方法 采用GEO数据库及GEPIA预 测FNDC1在肺腺癌的表达水平,进一步对92例肺腺癌组织及配对的相邻正常组织进行免疫组化染色,验证FNDC1的表达。分析FNDC1表达与肺腺癌患者临床特征之间的关系,使用Cox生存分析进一步研究其预后价值。 结果 GEO数据库及GEPIA结果显示,肺腺癌组织中FNDC1的表达水平高于其配对的正常组织（P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示,FNDC1蛋白表达量较高的患者的总生存期较短（P=0.035,0.036,0.00029）。免疫组化结果显示,与正常肺组织相比,肺腺癌组织FNDC1蛋白表达水平升高（P<0.001）。FNDC1蛋白的高表达与临床分期（P=0.044）、T分期（P=0.047）、N分期（P=0.003）存在相关性。Cox单变量及多变量回归生存分析结果显示,FNDC1表达水平增加是肺腺癌患者预后不良的独立危险因素（P<0.05）。结论 FNDC1蛋白在肺腺癌患者中高表达且与肺腺癌的发生发展及预后密不可分,有可能成为判断肺腺癌患者生存预后的标志物。     

FNDC5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染THP-1细胞系

目的：构建过表达Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5, FNDC5）基因的慢病毒载体,获得稳定转染FNDC5的THP-1细胞系。方法：PCR扩增目的基因FNDC5,将目的基因构建入pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro慢病毒载体中,在DH5α感受态细胞中进行扩增,测序及鉴定合格后利用四质粒包装系统转染293T细胞,包装成过表达慢病毒颗粒并测定病毒滴度。Western blot检测重组慢病毒中FNDC5的表达情况后,将获得的重组慢病毒转染THP-1细胞系,荧光显微镜观察并计算其转染效率。经嘌呤霉素筛选建立FNDC5过表达的稳转细胞系后,将细胞分为3组,分别为空白组、空载组和FNDC5组,用Western blot及RT-PCR检测其FNDC5的表达情况。通过油红O染色后观察FNDC5过表达对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的影响。结果：PCR产物鉴定及测序结果显示成功构建FNDC5过表达慢病毒载体;转染293T细胞后可检测到绿色荧光,Western blot检测FNDC5-Flag标签有表达,包装后病毒的滴度为1.32×109 TU/mL;Western blot及RT-PCR检测重组慢病毒转染THP-1细胞系,与空载组对比,FNDC5组中FNDC5蛋白表达明显增加[（238.0±24.9）％],有统计学意义（P=0.000）;与空载组对比,FNDC5组中FNDC5 mRNA表达水平明显增加[（228.5±3.4）％],有统计学意义（P=0.000）。FNDC5过表达转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中的脂质蓄积减少。结论：本实验成功构建了FNDC5基因的过表达慢病毒载体,通过FNDC5过表达慢病毒感染建立了FNDC5稳转的THP-1细胞系,证明FNDC5可明显减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的脂质蓄积,为后续研究奠定基础。     

KAI1蛋白在食管癌组织中的表达

目的探讨KAI1蛋白的表达与食管癌发生及浸润转移的关系。方法采用免疫组织化学方法,检测160例食管癌组织及相应病例150例正常粘膜中KAI1蛋白的表达。结果KAI1蛋白在癌组织中的表达明显低于其正常粘膜(P<0.05),在有淋巴结转移病例中的表达明显低于无淋巴结转移病例(P<0.05)。KAI1蛋白的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度无关(P>0.05)。结论KAI1蛋白低表达与食管癌的癌变和淋巴结转移有关,KAI1的功能下调使得细胞具有恶性侵袭性。     

HIF-1在食管癌中的表达及临床意义

目的：探讨缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）与食管癌发生、发展及预后的关系。方法采用免疫组织化学SP法检测82份食管癌组织与相应癌旁组织（距离病灶5cm）中HIF-1的表达情况,随后分析其与食管鳞癌患者临床病理特征及预后的关系。结果癌组织、癌旁组织中HIF-1过表达率分别为51.2%（42／82）,9.8%（8／82）,差异有统计学意义（P〈0.05）;HIF-1过表达在不同分化程度及是否伴有淋巴结转移上差异有统计学意义（P〈0.05）,HIF-1阳性组与阴性组2年生存率分别为64.3（27/42）,82.5（33/40）。结论 HIF-1过表达促进食管癌发生、发展并且与食管癌的预后密切相关。     

食管癌患者血清中DKK-1的表达

目的 探讨DKK-1在食管癌患者血清中表达的临床意义。方法 应用酶联免疫（Elisa）法检测80例食管鳞癌患者和35例正常人血清中的DKK-1的表达水平,并与常规肿瘤标记物进行比较,探讨其在食管癌中的诊断价值。结果 食管鳞癌患者血清中DKK-1浓度为（90.44±57.41）ng／mL,而正常人血清浓度为(11.29±9.45)ng／mL,两者之间差异有统计学意义（P<0．01）。若以正常人血清DKK-1浓度95％可信区间上限为界值(14.54ng／mL),则食管癌鳞患者血清中DKK-1的敏感性为66.25％(53／80),特异性为82.86％;血清中的DKK-1的阳性率仅为17.14％(6／35),两者之间差异有统计学意义(P<0．01)。经过统计学分析显示,食管鳞癌患者血清中的DKK-1水平与肿瘤大小、分期及淋巴结转移等因素相关(P<0．05),而与性别、年龄及肿瘤的分化程度无关（P＞0.05）。通过与其他标记物比较发现DKK-1的检测对食管鳞癌诊断的敏感度明显高于常规肿瘤标记物(CEA 39.44%,CYFRA21-1 25.35%,P<0．01),三者联合检测能明显提高诊断食管癌的敏感性。结论 DKK-1可作为检测食管癌的一种新的肿瘤标记物,对食管癌的诊断和病情评估有一定的辅助参考价值。     

食管癌组织中KAI1基因的表达

目的探讨KAI1基因的表达与食管癌浸润转移的关系.方法采用RT-PCR及免疫组化方法,检测35例食管癌组织及其正常黏膜中KAI1 mRNA及蛋白的表达.结果在食管癌组织及其正常黏膜中,KAI1 mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05),而癌组织中KAI1蛋白的表达明显低于其正常黏膜(P＜0.05),但KAI mRNA及蛋白表达均与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移无关(P＞0.05).结论食管癌癌变可能与KAI1蛋白的低表达有关,但与KAI1 mRNA的表达无关,推测这可能是由于翻译后修饰所致.     

SATB1基因在食管癌中的表达及临床意义

目的:探讨特异AT序列结合蛋白1(SATB1)在食管癌手术标本中的表达及其临床意义。方法:应用免疫组织化学S-P法和荧光定量PCR方法分别检测食管癌和癌旁组织中SATB1蛋白和mRNA的表达。结果:SATB1蛋白在食管癌中的表达与癌组织的肿瘤细胞分化程度、病理学分期和淋巴结转移等呈正相关(P<0.05),而与病人年龄、性别等无明显相关(P>0.05);SATB1 mRNA在食管癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.05)。结论:SATB1的表达与食管癌的发生发展及转移密切相关。     

食管癌变过程中PLCE1蛋白的表达

目的探讨PLCE1蛋白的表达变化与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)发生的关系。方法选择138例ESCC患者手术切除标本的正常、癌旁及癌组织,采用免疫组织化学ABC法检测PLCE1蛋白的表达。结果 PLCE1蛋白在正常食管鳞状上皮、癌前病变和癌组织中的阳性表达率分别为41%、82%和83%(P<0.05);高发区/低发区及家族史阳性/家族史阴性亚组分析PLCE1蛋白阳性表达率无差异(P>0.05)。结论 PLCE1蛋白和ESCC癌变有关,PLCE1可能作为致病基因促进ESCC的发生发展。     

Cyclin D1在食管癌中的表达及其临床意义

【目的】检测食管癌中CyclinD1的表达并探索其临床意义。【方法】运用RT-PCR与组织芯片免疫组化法检测CyclinD1在食管癌组织、配对的邻近食管上皮中的表达状态。分析探讨CyclinD1的表达状态与食管癌临床和病理参数之间的关系。【结果】61%和35%的病例分别在食管鳞癌及其邻近上皮组织中显示CyclinD1表达增加。食管癌组织与其邻近的上皮组织之间CyclinD1的表达具有显著差异(!2=8.776,P<0.01)。不同T分期的肿瘤组织中CyclinD1的表达差异具有统计学意义,在T3+T4期的表达率为70%,T1+T2期的表达率为40%(T3+T4vsT1+T2,!2=5.363,P<0.05);在T3期的表达率为70%,T1期的表达率为30%(T3vsT1,!2=4.646,P<0.05)。【结论】CyclinD1可能是参与食管癌化的分子标志物,并且可能是区分不同食管癌T分期的有价值的分子标志物。     

Cyclin D1在食管癌中的表达及其临床意义

【目的】检测食管癌中Cyclin D1的表达并探索其临床意义。【方法】运用RT-PCR与组织芯片免疫组化法检测Cycfin D1在食管癌组织、配对的邻近食管上皮中的表达状态。分析探讨Cycfin D1的表达状态与食管癌临床和病理参数之间的关系。【结果】61％和35％的病例分别在食管鳞癌及其邻近上皮组织中显示Cychn D1表达增加。食管癌组织与其邻近的上皮组织之间Cychn D1的表达具有显著差异（x^2=8．776．P〈0．01）。不同T分期的肿瘤组织中Cyclin D1的表达差异具有统计学意义，在T3＋T4期的表达率为70％，T1＋T2期的表达率为40％（T3＋T4vsT1＋T2，x^2=5．363，P〈0．05）；在T3期的表达率为70％，T1期的表达率为30％（T3vsT1，x^2=4．646，P〈0．05）。【结论】Cyclin D1可能是参与食管癌化的分子标志物，并且可能是区分不同食管癌T分期的有价值的分子标志物。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

gp350胞外段基因表达载体的构建与表达

目的 构建gp350与C3d融合基因表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 以pGEX-gp350为模板,经PCR获得长846bp的gp350胞外段(25-870),将该扩增片段插入pSG.SS.C3d3.YL载体,构建pSG.SS.gp350.C3d3.YL表达质粒.经限制性内切酶鉴定和DNA序列测定证实后,将该质粒转染Hela细胞,检测其体外表达.结果 免疫细胞化学分析结果表明转染细胞有目的 分子的表达. 结论 构建的重组载体可在真核细胞内正确表达,这为基于gp350的鼻咽癌预防性疫苗下一步的动物实验奠定了基础.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达

目的:构建小鼠GITR(mGITR)的真核表达载体,转染COS-7 细胞表达小鼠GITR 蛋白.方法:用TRIzol 试剂抽提小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR 扩增出GITR 全长基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-mGITR,经鉴定后采用脂质体介导DNA 法转染COS-7 细胞.结果:从小鼠脾细胞中成功扩...     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。