高磷、高钙诱导人血管平滑肌细胞钙化的研究

目的：探讨高磷及高钙诱导血管平滑肌细胞发生钙化的分子机制。方法：以人血管平滑肌细胞（ VSMCs）为模型,采用不同钙磷浓度的培养基与细胞共培养12 d,将细胞分为正常钙、磷组（对照组）、高磷组、高钙组和高磷﹢高钙组,分别采用免疫印迹（ western-blot）技术、逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）技术检测人血管平滑肌细胞核心结合因子α1（Cbfα1）、骨钙素、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白质和mRNA的表达;高磷﹢高钙条件孵育下的细胞加入ZVAD-FMK干预后,再次采用western-blot技术检测Cbfα1、骨钙素蛋白质表达的情况。结果：试验组Cbfα1、骨钙素表达增强（ P=0.013;P=0.007）,而肌成纤维细胞的特异性标志物α-SMA表达下降（P=0.009）,对照组上述3个指标无明显变化（P=0.055、P=0.074、P=0.63）;加入ZVAD-FMK与高磷﹢高钙组细胞共培养后,Cbfα1、骨钙素蛋白质的表达受到明显抑制。结论：高磷或（和）高钙通过使血管平滑肌细胞转化为成骨样细胞而导致钙化的发生;ZVAD-FMK可以在一定程度上抑制这一病理生理进程,提示凋亡和成骨分化均参与了钙化过程。     

酸性环境抑制高磷诱导大鼠VSMCs 钙化的机制研究

目的 探讨酸性环境对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的影响及其机制。 方法 体外分离培养大鼠VSMCs,采用免疫细胞化学法鉴定。将VSMCs 按随机数字表法分为正常对照组、 高磷＋ pH 7.4 组、高磷＋ pH 7.1 组。刺激4 d 后,采用逆转录聚合酶链反应和Western blot 检测活化T 细胞 核因子c1（NFATc1）、Runt 相关转录因子2（Runx2）基因和蛋白的表达。刺激14 d 后,对各组细胞进行 钙化染色、钙含量和碱性磷酸酶（ALP）活性测定。结果 与正常对照组比较,高磷＋ pH 7.4 组的钙含量、 ALP 活性、Runx2 和NFATc1 表达升高（P <0.05）;与高磷＋ pH 7.4 组比较,高磷＋ pH 7.1 组的钙含量、 ALP 活性、Runx2 和NFATc1 表达降低（P <0.05）。相关性分析发现,NFATc1 蛋白表达水平与ALP 活性、 Runx2 蛋白表达水平呈正相关（P <0.05）。结论 酸性环境可以抑制高磷诱导的大鼠VSMCs 钙化,其机制可 能是通过降低NFATc1 表达,抑制VSMCs 表型转化来实现的。     

高磷对大鼠血管平滑肌细胞钙化及核心结合因子α1表达的影响

[目的]研究高磷对体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙沉积以及核心结合因子α1 (Cbfα1)的影响.[方法] 体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,根据培养基中磷浓度分为:正常磷浓度(磷浓度1.4 mmol/L)和高磷浓度(磷浓度2.4 mmol/L)组,培养第3 d、6 d、9 d后,BCA法检测细胞内钙含量,放射免疫方法检测培养液骨钙素含量,ELISA检测细胞Cbfα1与DNA结合活性.[结果] 正常磷浓度组VSMCs钙含量在9 d内无明显变化.高磷浓度组第3、6、9天细胞钙含量比第0天明显增高(P<0.01).高磷浓度组细胞钙含量在第3、6、9天均明显高于相同时间点正常磷浓度组(P<0.05).培养3 d后,高磷浓度组培养上清液骨钙素水平明显高于正常磷浓度组,(14.62±2.93)pg/μg蛋白vs (2.83±0.64)pg/μg蛋白,P<0.01.Cbfα1活性在正常磷浓度组细胞9 d内无明显变化;但在高磷浓度组6、9天与第0天比明显增强(P<0.05).高磷浓度组在第6、9天细胞Cbfα1活性与相同时间点正常磷浓度组比明显增强(P<0.05).[结论] 高磷可直接刺激大鼠VSMC的钙沉积和骨钙素产生,其作用可能与高磷上调VSMC的Cbfα1表达有关.     

内质网应激参与高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的作用机制

目的 探讨内质网应激是否参与高磷诱导血管平滑肌细胞钙化及其作用机制。方法 体外培养人胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）,分为对照组、正常磷组（1.3 mmol/L磷,NP组）、高磷组（2.6 mmol/L磷,HP组）,培养10 d。茜素红染色后观察细胞钙盐沉积情况;实时定量PCR和Western blotting检测肌醇需求因子1 (IRE1)、RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PERK）、内质网应激标志蛋白C/EBP同源蛋白（CHOP）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、骨形态发生蛋白2 (BMP-2)及Runt相关转录因子2 (Runx-2)的表达;应用CHOP siRNA转染高磷培养VSMC敲低CHOP表达后,检测BMP-2及Runx-2表达;应用JNK抑制剂SP600125 (DMSO溶解),终浓度10μmol/L预处理30 min后加入高磷培养基培养10 min,茜素红染色观察钙沉积情况。结果 与对照组及NP组比较,HP组内质网应激蛋白（IRE1、PERK、JNK、CHOP）及钙化蛋白（BMP-2、Runx-2）均明显增高（均P <0.01）。敲低CHOP表达后钙化蛋白...     

microRNA在高磷诱导血管平滑肌细胞钙化早期的动态变化

目的：观察高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化早期microRNA表达变化,分析其可能参与的信号通路途径。方法：采用高磷（无机磷 2.6 mmol/L）刺激大鼠血管平滑肌细胞系A7r5钙化7 d,邻甲酚酞络合酮比色法和考马斯亮蓝法检测细胞内钙含量,RT PCR法检测平滑肌细胞表型和钙化相关基因的表达变化,茜素红染色观察钙结节。microRNA microarray 法检测高磷刺激后0、3、12 h,680种microRNA表达变化。采用TAM软件分析不同时间点间信号激活情况。结果：高磷诱导的A7r5细胞钙盐含量升高9.6倍（P<0.05）,平滑肌细胞表型mRNA（SM-α actin,SM22）下调（P<0.05）, 钙化相关mRNA（BMP2、MSX2、Runx2）上调（P<0.05）,茜素红染色后可见高磷刺激组有明显钙结节。680种microRNA在3个时间点的表达各不相同,只有6种microRNA分别逐级上调或渐渐下调。26种信号通路被明显激活,其中包括细胞凋亡、分化增殖等已知与钙化相关的信号通路。结论：microRNA参与调节血管钙化是一种动态微调的过程,为血管钙化研究带来新的思路。     

维拉帕米通过阻断钙离子内流抑制血管平滑肌细胞钙化研究

目的 探讨维拉帕米抑制高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的作用及可能机制。方法 2014年12月-2015年6月选取5～8周龄清洁级健康雄性SD大鼠6只,体外分离培养大鼠VSMCs,采用免疫组化法鉴定。将对数期VSMCs随机分为正常对照组〔含10%胎牛血清（FBS）培养基〕、高磷组（高磷培养基,含10 mml/L β-甘油磷酸）、维拉帕米干预组（在高磷培养基的基础上加入维拉帕米至浓度为20 mmol/L）。细胞接受2、4、6 d干预后,检测VSMCs内钙离子水平,采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测VSMCs内目的基因（smad1、runx2 mRNA）表达水平。细胞接受14 d干预后进行钙化检测,包括钙水平测定和茜素红染色情况。结果 高磷组、维拉帕米干预组2、4、6 d后VSMCs内钙离子水平均高于正常对照组（P＜0.05）;维拉帕米干预组2、4、6 d后VSMCs内钙离子水平均低于高磷组（P＜0.05）。高磷组、维拉帕米干预组4、6 d后VSMCs内钙离子水平分别高于2 d后（P＜0.05）;高磷组6 d后VSMCs内钙离子水平高于4 d后（P＜0.05）;维拉帕米干预组6 d后VSMCs内钙离子水平低于4 d后（P＜0.05）。高磷组、维拉帕米干预组2、4、6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平均高于正常对照组（P＜0.05）;维拉帕米干预组2、4、6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平均低于高磷组（P＜0.05）。高磷组4、6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平分别高于2 d后,6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平分别高于4 d后（P＜0.05）;维拉帕米干预组4 d后VSMCs内smad1 mRNA表达水平高于2 d后,runx2 mRNA表达水平低于2 d后,6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平均高于2、4 d后（P<0.05）。高磷组、维拉帕米干预组VSMCs钙水平均高于正常对照组（P＜0.05）;维拉帕米干预组VSMCs钙水平低于高磷组（P＜0.05）。高磷组、维拉帕米干预组橘红色钙化结节较正常对照组多,维拉帕米干预组橘红色钙化结节较高磷组少。结论 维拉帕米在高磷诱导的VSMCs钙化中起抑制作用,其可能是通过抑制钙离子内流进而抑制smad1表达,进一步抑制runx2表达,进而抑制VSMCs发生表型转化来实现的。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ抑制高磷诱导血管平滑肌细胞钙化

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptor γ,PPARγ)对高磷诱导的小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化的抑制作用.方法 体外培养小鼠血管平滑肌细胞,先分正常对照组、高磷组(HP,2.6 mmol/L),观察高磷对VSMCs的影响,再分为正常对照组、高磷组(HP,2.6 mmol/L)、罗格列酮组(RGL,10 μmol/L)、高磷(2.6 mmol/L)±罗格列酮(10 μmol/L)组(HP+RGL),观察PPARγ激动剂罗格列酮对高磷诱导的VSMCs钙化的抑制作用.茜素红S(alizarin red S)染色观察高磷对细胞钙盐沉积的影响.Western blot检测PPARγ、血管平滑肌22alpha蛋白标志物(SM22α)、骨形成蛋白2(BMP2)和成骨特异性转录因子2(Runx2)的表达变化.结果 与正常对照组相比,高磷处理后的VSMCs的钙盐沉积明显升高[(0.08 ±0.02)vs(0.19 ±0.03),P＜0.01],成骨细胞标志物BMP2[(0.26 ±0.02) vs (0.74±0.03),P＜0.01]及Runx2表达[(0.29 ±0.03) vs (0.91 ±0.04),P＜0.01)],明显升高.同时PPARγ[(0.93±0.04)vs(0.58±0.02),P＜0.05]及平滑肌细胞标志物SM22α表达减少[(1.02±0.09) vs(0.77±0.03),P＜0.05],而加入罗格列酮后,高磷状态下VSMCs的钙盐沉积明显降低[(0.19±0.02) vs(0.12±0.03),P＜0.05],PPARγ[(0.63 ±0.04)vs(0.85 ±0.03),P＜0.05]和SM22α[(0.69 ±0.02) vs(0.99±0.03),P＜0.01]表达明显上升,相反,BMP2[(1.02±0.04) vs (0.48±0.05),P＜0.01]及Runx2[(1.00 ±0.06) vs (0.67 ±0.03),P＜0.01]的表达则明显受抑.结论 高磷诱导VSMCs向成骨细胞分化和钙化可能与下调PPARγ的表达有关,而罗格列酮可通过激活PPARγ抑制高磷状态下VSMCs钙化的发生.     

Let-7b-5p靶向ETFA减轻高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的机制研究

目的:探讨Let-7b-5p调控电子转移黄素蛋白A(ETFA)表达对高磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响.方法:体外培养VSMCs,分为正常对照组和钙化组.钙化组用含β-甘油磷酸钠(β-GP)的培养基培养14 d诱导VSMCs钙化,通过茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)染色观察VSMCs钙化情况.分别将Let-7b-5p mimic、Let-7b-5p inhibitor、ETFA siRNA及相应对照转染VSMCs,并诱导细胞钙化.用RT-qPCR法检测细胞Let-7b-5p、ETFA及Runx2表达,Western blotting法检测ETFA和Runx2蛋白表达.双荧光素酶实验验证Let-7b-5p与ETFA的靶向关系.结果:与正常对照组比较,钙化组出现明显的紫红色钙盐结节,Let-7b-5p表达显著下调,ETFA和成骨细胞因子Runx2表达明显上调(均P＜0.05).Pearson相关分析显示,Let-7b-5p与ETFA表达呈负相关关系(r=-0.785,P＜0.001),ETFA与Runx2表达呈正相关关系(r=0.962,P＜0.001).Let-7b-5p mimic能显著降低钙化细胞Runx2和ETFA的表达及ALP活性,而Let-7b-5p inhibitor则相反.Let-7b-5p可靶向调控ETFA表达.沉默ETFA后,钙化VSMCs中ETFA和Runx2表达显著下降,钙盐结节明显减少.结论:Let-7b-5p可通过靶向抑制ETFA的表达抑制高磷诱导的VSMCs钙化.     

槲皮素调节ROS/TLR4信号通路抑制Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞钙化

目的观察槲皮素对氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导的血管平滑肌细胞成骨样分化和钙化的作用,并阐明其分子机 制。方法采用Ox-LDL处理人血管平滑肌细胞,茜素红染色检测细胞钙化,测定碱性磷酸酶（ALP）活性和qPCR测骨相关蛋白 Msx2、BMP2、Osterix 以及收缩蛋白SMA和SM22α mRNA表达水平。观察槲皮素对Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞钙化, ALP活性,TLR4、Msx2、BMP2、Osterix、SMA和SM22α的mRNA表达水平,ROS含量及SOD活性的影响。采用TLR4 siRNA 转染血管平滑肌细胞,观察敲低TLR4对细胞钙化,ALP活性及Msx2、BMP2、Osterix、SMA和SM22α mRNA表达水平的影响。 结果Ox-LDL可促进血管平滑肌细胞钙化和上调TLR4表达水平（P<0.05）;槲皮素能明显减轻Ox-LDL诱导的细胞钙化和降低 ALP的活性,下调Msx2、BMP2、Osterix mRNA的表达水平,上调血管平滑肌收缩蛋白SMA 和SM22α mRNA的表达水平（P< 0.05）。此外,槲皮素可明显提高SOD的活性,降低活性氧物质（ROS）的含量,下调TLR4的表达水平（P<0.05）;TLR4 siRNA也 能减轻Ox-LDL诱导的细胞钙化（P<0.05）。结论槲皮素可明显抑制Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞钙化,其机制可能与ROS 激活的TLR4信号通路有关。     

血管紧张素-(1-7)对人脐静脉平滑肌细胞钙化的影响及其机制研究

目的复制人脐静脉平滑肌细胞(HUSMCs)钙化模型,观察血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对HUSMCs钙沉积的影响,探索Ang-(1-7)延缓或抑制HUSMCs钙化的机制。方法采用β-甘油磷酸盐(β-GP)复制HUSMCs钙沉积模型,Ang-(1-7)干预后,对细胞进行Von Kossa染色及图像分析、检测碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞钙含量;检测细胞培养液中转化生长因子β1(TGFβ1)活性、骨钙素(OC)含量及细胞中核心结合因子1(Cbfα1)蛋白表达。结果 Ang-(1-7)可明显减轻钙化HUSMCs聚集生长,Von Kossa染色显示细胞聚集处棕褐色钙结节较钙化组明显减轻(P<0.01),且10-5、10-7、10-9mol.L-1Ang-(1-7)与钙化组相比钙化细胞百分比、细胞钙含量和ALP活性均明显降低(P均<0.01),细胞TGFβ1分泌水平、Cbfα1表达、骨钙素含量均较钙化组降低(P均<0.01)。结论 Ang-(1-7)可减轻HUSMCs钙化程度,其作用机制与减弱TGFβ1-Smads-Cbfα1信号通路中关键信号分子TGFβ1、Cbfα1的表达有关。     

PPARα对糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞的作用

目的:观察氯贝特对糖基化终产物(AGEs)刺激下的离体大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用以及对过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)基因及蛋白表达水平的影响,探讨PPARα在AGEs诱导VSMCs增殖中的作用。方法:体外培养大鼠VSMCs,应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,采用MTT法观察不同浓度的AGEs对VSMCs增殖的影响及氯贝特与AGEs共孵育对VSMCs增殖的干预作用,并用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测PPARα的mRNA表达,Western blotting分析PPARα的蛋白表达。结果:AGEs增加DNA的合成促进平滑肌细胞的增殖,氯贝特激活PPARα,使PPARα的表达量增加,抑制AGEs诱导的细胞增殖和DNA合成。结论:AGEs诱导平滑肌细胞增殖与平滑肌细胞PPARα表达相关,PPARα表达下调可能是产生糖尿病动脉粥样硬化的重要原因之一。     

荜茇明碱抑制BMP2/pSmad1/5信号减轻高钙高磷诱导的主动脉瓣膜间质细胞钙化

目的：探究荜茇明碱对高钙高磷诱导的主动脉瓣膜间质细胞（aortic valve interstitial cell,AVIC）钙化的保护作用及其机制。方法：体外培养原代猪AVIC,通过高钙高磷诱导钙化并给予不同浓度荜茇明碱处理16 h后,流式细胞仪分析检测凋亡水平;AVIC在高钙高磷条件下,以2.5 mmol/L荜茇明碱或100 ng/mL骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）处理,通过检测钙浓度、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、茜素红染色反映钙化程度;Western blot、real?time PCR检测成骨相关蛋白和mRNA的表达。结果：①流式细胞分析发现,高钙高磷条件下,荜茇明碱低于5 mmol/L无明显促凋亡作用;②钙浓度、ALP活性、茜素红染色显示,2.5 mmol/L荜茇明碱显著抑制高钙高磷诱导的AVIC钙化;③Western blot、real?time PCR显示,2.5 mmol/L荜茇明碱抑制BMP2、pSmad1/5、RUNX2蛋白和mRNA的表达;④外源性重组BMP2可逆转荜茇明碱抗钙化的作用。结论：荜茇明碱通过抑制 BMP2/pSmad1/5/RUNX2 信号,减轻高钙高磷诱导的 AVIC钙化。     

镁对人血管平滑肌细胞钙化的作用

目的：研究镁对高钙高磷诱导的人血管平滑肌细胞（hVSMC）钙化的影响。方法：无菌条件下提取胎儿脐动脉平滑肌细胞,分为正常对照组（A组）、高钙高磷组（B组）、高钙高磷+硫酸镁组（C组）。B组、C组培养3 d后,部分（B1组、C1组）继续高钙高磷培养液培养,部分（B2组、C2组）换用普通培养液培养。于12h、24 h、72 h、第4、第7、第10天测定细胞层钙含量,并采用Western blot法测定核心结合因子1（cbfa1）、磷酸核糖焦磷酸合成酶2（Prps2）蛋白表达水平。结果：B组钙含量升高,C组较B组、C1组较B1组、C2组较B2组,钙含量均明显下降（P＜0.05）。Western blot结果显示,12 h、24 h、72 h B组Cbfa1表达升高,C组表达降低（P＜0.05）;第4、第7、第10天,C1组较B1组、C2组较B2组,Prps2表达升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：高钙高磷促进hVSMC钙化,镁抑制了hVSMC钙化进展,激活了Prps2蛋白表达,促进了钙化消退。     

肾元颗粒对db/db糖尿病肾病小鼠血管钙化的改善作用及其机制

目的：通过高磷诱导db/db糖尿病肾病（DN）小鼠血管钙化,探讨肾元颗粒对db/db DN小鼠血管钙化的改善作用及其可能机制。方法：将20只SPF级db/db小鼠随机分为模型组和肾元颗粒组（n=10）,同系背景野生型（WT）小鼠作为空白组（n=10）。给药12周后,取各组小鼠血清、肾脏和胸主动脉组织。ELISA法检测各组小鼠血清FGF23水平,HE和von Kossa法检测各组小鼠胸主动脉病理形态表现以及钙盐沉积情况,实时荧光定量PCR （Real-time PCR）法检测各组小鼠肾脏组织中KlothomRNA和胸主动脉组织中Pit-1、Runx2及SM22α mRNA表达水平,Western blotting法检测各组小鼠肾脏组织中Klotho蛋白和胸主动脉组织中Pit-1、Runx2及SM22α蛋白表达水平,免疫组织化学法检测各组小鼠胸主动脉组织中Pit-1蛋白表达水平,免疫荧光法检测各组小鼠胸主动脉组织中SM22α和Runx2蛋白表达水平。结果：与空白组比较,模型组小鼠血清FGF23水平明显升高（P<0.05）,肾脏组织中Klotho mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,胸主动脉组织中Pit-1和Runx2 mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,SM22α mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,胸主动脉组织中Pit-1和Runx2蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,SM22α蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与模型组比较,肾元颗粒组小鼠血清FGF23水平降低（P<0.05）,肾脏组织中Klotho mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,胸主动脉组织中Pit-1和Runx2 mRNA及蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,胸主动脉组织中SM22α mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论：肾元颗粒可通过上调小鼠肾脏组织中Klotho蛋白表达水平,减少Pit-1表达水平,抑制FGF23/Pit-1信号通路,调节血管平滑肌细胞（VSMC）的表型转化,达到血管保护作用。     

镁离子对大鼠血管平滑肌细胞钙化相关因子表达的影响

目的 探讨镁离子对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化相关因子表达水平的影响。方法 选择5周龄健康雄性SD大鼠6只。以组织贴壁法进行原代VSMCs培养,至3～5代时用于细胞实验。将VSMCs采用随机数字表法分为正常对照组、高磷组（加入10 mmol/L β-甘油磷酸）、镁干预组〔加入10 mmol/L β-甘油磷酸＋3 mmol/L硫酸镁（MgSO4）〕、2-氨基乙氧基二苯基硼酸（2-APB）干预组（10 mmol/L β-甘油磷酸＋3 mmol/L MgSO4＋10-4 μmol/L 2-APB）。采用邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞培养14 d后钙化情况,酶联免疫吸附法检测细胞培养14 d后碱性磷酸酶（ALP）活性,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测0、3、6、10、14 d时细胞内基质G蛋白（MGP）mRNA和骨桥蛋白（OPN）mRNA的表达水平。结果 细胞培养14 d后,4组钙水平比较,差异有统计学意义（F=409.800,P＜0.05）;高磷组、2-APB干预组钙水平高于正常对照组和镁干预组 （P＜0.05）。4组ALP活性比较,差异有统计学意义（F=490.901,P＜0.05）;高磷组、2-APB干预组ALP活性高于正常对照组和镁干预组 （P＜0.05）。培养14 d后,4组MGP mRNA和OPN mRNA的表达水平比较,差异有统计学意义（F=1 279.905、1 157.247,P＜0.05）;镁干预组MGP mRNA和OPN mRNA的表达水平高于高磷组及2-APB干预组 （P＜0.05）。动态观察MGP mRNA和OPN mRNA的表达变化,结果显示在培养第3天时,高磷组MGP mRNA和OPN mRNA表达水平均降低（P＜0.05）,并随着时间的延长呈下降趋势|镁干预组MGP mRNA和OPN mRNA表达水平均升高（P＜0.05）,并随着时间的延长呈上升趋势。结论 高浓度镁离子在抑制VSMCs钙化过程中可上调MGP及OPN的表达,并呈一定时间依赖性,为临床进一步研究提供了参考依据。     

机械牵张引起高张应变刺激小鼠血管平滑肌细胞钙化形成

目的探索机械牵张(mechanical stretch, MS)引起的高张应变对血管平滑肌细胞钙化的影响。方法选用小鼠主动脉平滑肌细胞MOVAS,应用定制的硅胶板牵张器,牵张20%幅度的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs）作为实验组,模拟高血压下的高张应变环境;将不进行牵张的VSMCs作为对照组。使用荧光定量PCR和Western印迹法检测细胞α-SMA、Runx2基因和蛋白的表达,荧光定量PCR检测骨钙素(osteocalcin）、骨桥蛋白（osteopontin）的表达,使用邻甲酚酞络合酮比色法定量检测两组细胞钙化沉积,使用对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性。结果在细胞维持贴壁生长的72h以内,随着牵张时间的增加,血管平滑肌细胞的α-SMA表达下降,Runx2、osteocalcin、osteopontin表达水平增加,钙化沉积和ALP活性增加。结论牵张后的高张应变可以诱导血管平滑肌细胞钙化形成。     

骨钙素及I型胶原在体外血管钙化细胞中的表达

目的：检测骨钙素（osteocalcin OC)及I型胶原（collagen I Col I）在体外血管钙化细胞中的表达。方法：建立体外血管钙化细胞模型（钙化BASMCs),比色法检测细胞层钙含量、放免法检测培养上清OC浓度，逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测OC、Col I mRNA表达。结果：钙化BASMCs中钙沉积增加呈时间及剂量依赖性；培养上清OC含量在钙化过程中随时间延长呈升高趋势，至第8天升至最高，继而轻度下降；OC及Col I mRNA在钙化BASMCs中表达分别增加128．05％及116．84％。结论：钙化BASMCs中OC及Col I表达增加，是一较好的研究血管钙化的体外模型。     

罗格列酮延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展

目的: 观察罗格列酮对糖尿病大鼠钙化血管的治疗作用及对骨转录因子Msx2表达的影响.方法: 在高脂饮食加小剂量链脲佐菌素腹腔注射处理的基础上,加用维生素D3和尼古丁处理,制备糖尿病合并血管钙化大鼠模型(糖尿病合并血管钙化组),给予部分糖尿病合并血管钙化组大鼠罗格列酮灌胃 (2 mg·kg-1,每天1次,共8周)处理(罗格列酮组),同时设立空白对照组.实验第21周末,处死各实验组大鼠,检测各组大鼠的代谢指标,进行血管 von Kossa染色,检测血管钙含量和碱性磷酸酶活性,应用real-time PCR方法检测 Msx2 mRNA 及蛋白免疫印迹方法检测 Msx2 蛋白在血管中的表达变化.结果: 与对照组相比,糖尿病合并血管钙化组大鼠血管内存在弥漫性的钙盐沉积,血管内钙含量增高,碱性磷酸酶活性增强,Msx2 mRNA和蛋白表达明显增高 (均P<0.05);而给予罗格列酮处理后,钙盐在血管内的沉积明显减少,钙含量和碱性磷酸酶活性分别下降8.37%、10.59%,Msx2 mRNA和蛋白表达也分别下降 36.73 %、 42.55 %(与糖尿病合并血管钙化组相比,均P<0.05).结论: 罗格列酮可以延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展,并可以减少钙化血管中Msx2的表达.     

高磷诱导及膦甲酸钠干预血管平滑肌细胞钙化的研究

目的 观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素表达的影响,同时观察膦甲酸钠对高磷诱导该细胞钙化的干预作用.方法 体外培养牛主动脉平滑肌细胞,观察不同磷浓度(Pi 1.5、2.0 mmol·L-1)、不同培养时间(3、6、9 d)血管平滑肌细胞的钙沉积,以及不同磷浓度(Pi 1.5、2.0、2.5 mmol·L-1)培养血管平滑肌细胞72 h骨钙素的表达.同时观察不同浓度膦甲酸钠对高磷(Pi 2.0 mmol·L-1)诱导的钙沉积和骨钙素增加的抑制作用.用甲O-酚酞络合酮方法测定钙含量;放射免疫法测定培养上清液中骨钙素的浓度;BCA法测定蛋白含量,用蛋白含量标化钙含量与骨钙素浓度;RT-PCR测定骨钙素mRNA的表达.结果 在相当于正常血磷浓度(1.5 mmol·L-1)的培养基中,平滑肌细胞钙沉积量小;而在相当于高磷血症(2.0 mmol·L-1)的培养基中,钙沉积明显增加[培养6 d,(77.187±11.692) vs(25.768±1.750) μg·(mg蛋白)-1,P＜0.01],并呈时间和剂量依赖性.与Pi 1.5 mmol·L-1组相比,Pi 2.0 mmol·L-1组培养上清液中骨钙素的水平明显增高[(1.503×10-2±2.601×10-3) vs(2.981×10-3±8.382×10-4) ng·(μg蛋白)-1,P＜0.001];Pi 2.0 mmol·L-1组平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达也明显增加(OC/GAPDH,1.906±0.132 vs 0.748±0.0366,P＜0.001).膦甲酸钠能有效地抑制钙沉积[培养6 d,Pi 2.0 mmol·L-1 PFA 1.0 mmol·L-1组vs Pi 2.0 mmol·L-1组,(37.729±5.899) vs(77.187±11.692)μg·(mg蛋白)-1,P＜0.001]和上清液中骨钙素的表达[(4.529×10-3±1.250×10-3) vs(1.503×10-2±2.601×10-3) ng·(μg蛋白)-1,P＜0.001]及平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达(OC/GAPDH,0.642±0.092 vs 1.885±0.165,P＜0.01).结论 高磷能直接促进血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加,说明高磷血症可能是促进血管钙化的独立危险因素;膦甲酸钠能有效地抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加,可以作为一种新的防治高磷诱导血管钙化的药物.