重组人肝细胞生长因子β链工程菌的高密度发酵

目的　实现重组人肝细胞生长因子 β链 (rhHGFβ)工程菌的高密度高表达发酵。 方法　首先在摇瓶中进行了培养条件的摸索 ,确定了该工程菌的培养条件、诱导起始时间和诱导时间 ,然后用 15L自控发酵罐进行分批补料培养 ,发酵中分阶段限制性流加氮、碳源 ,保持溶氧在 30 %以上。结果　菌体发酵密度达到 39g/L(湿菌重 ) ,达到并超过了重组蛋白在摇瓶中的表达水平 ,重组蛋白的表达占菌体总蛋白的 30 %左右。结论　本研究为rhHGFβ进一步下游纯化及功能研究奠定了基础。     

酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因工程菌 ,为酶促转化法生产S 腺苷甲硫氨酸奠定基础。方法　应用PCR技术从S 腺苷甲硫氨酸高产酿酒酵母染色体DNA中扩增得到S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因sam2 ,将其克隆至表达载体pT7 7,转化大肠杆菌 ,1%琼脂糖电泳比较大小 ,筛选重组子。结果　SDS PAGE显示重组菌S 腺苷甲硫氨酸合成酶亚基分子量约为 4 2KDa ,平均表达量约占菌体总可溶性蛋白的 4 2 % ,酶活达到 14 .1U/g湿菌体 ,比宿主菌酶活提高 15 .7倍。结论　酿酒酵母SAM合成酶基因在大肠杆菌中高效表达 ,重组菌已具有初步的工业化应用价值     

溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌

目的 建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺.方法 以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS Bioflo Ⅳ 20 L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化.结果 保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2 mmol/L IPTG诱导5 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70 g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上.结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.     

高密度发酵制备重组人可溶性TRAIL

目的:利用原核重组表达技术,完成人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL,又称凋亡素2配体,Apo-2L)的中试.方法: 可溶性TRAIL编码基因插入改建的pBV220载体;在发酵过程中,控制溶解氧在30％～50％ ,30℃生长6 h,42℃诱导培养4 h;菌体上清行金属亲和层析.结果:发酵液中最终菌体密度D(600)达8.0(相当于每升发酵液含15 g湿菌体),TRAIL占菌体总蛋白的40％左右,含量超过0.6 g/L.其中,所表达的TRAIL 20％～30％在上清而直接有活性,70％～80％呈包涵体.上清用亲和层析一步使其纯度达70％以上;包涵体超声破菌后经两次洗涤,纯度达到80％以上. 结论:TRAIL在大肠杆菌中达到了高表达.     

重组人锰超氧化物歧化酶高密度发酵培养条件研究

目的:研究发酵罐中采用乳糖诱导高效表达重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的条件。方法:通过摇瓶和发酵罐培养研究了培养基、乳糖浓度、诱导时机、表达时间、溶氧条件、补料碳源种类对rhMn-SOD表达的影响。结果:乳糖诱导浓度为0.25%,溶氧浓度为40%～60%,用葡萄糖作为补料碳源进行高密度发酵,菌体密度A600达到28.98,菌体湿重达到60g/L,Mn-SOD活性达到18222.22U/g,比活为1057.5U/mg,实现了rhMn-SOD的高效表达。结论:对培养基配方和发酵条件进行了优化,为rhMn-SOD大规模生产奠定了基础。     

不同构建策略对D-氨基酸氧化酶表达的影响及发酵调节

目的 构建不含编码β-内酰胺酶编码基因的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)工程菌,对不同构建策略构建的重组菌进行发酵调节研究.方法 采用分子生物学手段,利用不同的策略、不同的毕赤酵母宿主菌,构建DAAO工程菌;利用微生物发酵和调节手段,对工程菌的发酵条件进行优化.结果 获得了表型不同的3株重组菌(Muts的PDK13和PDGA10,Mut 的PDG27),它们的最佳生长条件基本相似,诱导表达条件却不相同,在Basal salts培养基内,当生长时间为36 h,诱导培养基起始pH为6.0、甲醇浓度为0.5%时,最有利于DAAO表达.在菌体密度相同的条件下,Mut 表型(PDG27)甲醇代谢快,诱导24 h,DAAO活力达到最高;Muts型(PDK13和PDGA10)甲醇代谢慢,诱导36 h,DAAO活力达最高;通气量一定时,菌体密度增加,DAAO表达量增加,菌体增加到一定程度表达量反而下降,表明通气量应随菌体密度的增大而增加.结论 Muts型重组菌对通气量要求低且更有利于高密度发酵.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因工程菌的发酵工艺.方法先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件,并进一步对发酵工艺进行改良优化.结果经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合,优化后工程菌菌体产量平均可达40.5 g/L,目的蛋白的表达率平均为30.6%.结论建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺.     

重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究

目的：研究大肠杆菌表达重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB－UreB)融合基因工程菌BL21的发酵工艺，方法：采用德国B.Brau公司C－10型15L发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化，结果：在优化的条件下，15L发酵罐发酵工程菌，菌体收获量可达52．2g/L，目的蛋白表达量约占总蛋白的27％，结论：此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达。     

两阶段控制甘油浓度提高1,3-丙二醇发酵水平

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)分批发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD),根据菌体生长、产物生成和补料可将发酵过程分成4个阶段.不同阶段控制不同的底物浓度会对菌体生长和产物生成产生不同的影响.研究发现,菌体生长阶段(阶段Ⅱ)底物浓度控制在6.0 g/L最适合菌体生长,产物主要生成阶段(阶段Ⅲ)底物浓度控制在18.9 g/L最适合产物生成,菌浓可达7.83 g/L,最终1,3-PD的浓度为68.5 g/L,摩尔转化率为61%,生产强度为2.21 g/(L·h).     

脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆表达及酶活力测定

目的:在大肠杆菌中高效表达脱氢奎尼酸合成酶.方法:以大肠杆菌基因组为模板,采用PCR扩增得到脱氢奎尼酸合成酶基因aroB,并在大肠杆菌中进行表达.结果:在浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后aroB基因表达量占菌体总可溶性蛋白40.0%,SDS-PAGE显示重组菌诱导后表达的脱氢奎尼酸合成酶蛋白分子量约为38 kDa,发酵液中脱氢奎尼酸合成酶的酶活力达到178 U/L,为宿主菌的35.6倍.结论:脱氢奎尼酸合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达.     

血链球菌丙酮酸氧化酶基因表达克隆的构建与鉴定

目的 构建血链球菌丙酮酸氧化酶基因Sopox的表达质粒,为研究丙酮酸氧化酶基因Sopox表达的调节奠定基础。方法 将从血链球菌ATCC10557克隆的丙酮酸氧化酶基因Soopox重组到pBV220,表达载体,并转化入大肠杆菌E.coliJM105,观察Sopox基因在大肠杆菌中的表达。结果 通过酶切后电泳鉴定,Sopox基因重组入pBV220并转化入E.coliJM105;经42℃yte nf rg ,SDS-PAGE显示pBV220/Sopox/JM105表达分子量约为65kd的蛋白,与根据Sopox基因DNA序列预测的蛋白分子量一致;pBV220/Sopox/JM105的蛋白表达在42℃诱导4小时后达高峰。结论 丙酮酸氧化酶基因Sopox已被成功地克隆到pBV220/Sopox/JM105的蛋白表达在42℃诱导4小时后达高峰。结论 丙酮酸氧化酶基因Sopox已被成功地克隆到pBV220,并在E.coliJM105中表达。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的:利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的原核表达载体pBV220/mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法:制备重组质粒pGEM-T/hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果:重组原核表达质粒pBV220/mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论:成功构建了原核表达载体pBV220/mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

HLA-A2肽四聚体的构建及其在乙、丙型肝炎中的初步应用

目的　分别构建乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒 (HCV)特异的HLA A2肽四聚体 ,为检测乙、丙型肝炎患者体内特异性的细胞毒T细胞 (CTL)提供直接、有效的方法 ,指导临床用药。方法　分别构建含有HLA A2 BSP(含有 15个可供识别生物素化的氨基酸位点 )和 β2微球蛋白(β 2m)基因的原核表达载体 ,并进行表达、复性、鉴定及纯化。再分别将HBV和HCV特异性短肽与HLA A2 BSP和 β 2m蛋白在体外进行耦合 ,该复合物经纯化浓缩后进行生物素化。生物素化的产物经纯化浓缩后形成单体 ,此单体再与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成四聚体 ,最后进行流式细胞仪检测。结果　获得了高效、稳定的pBV2 2 0 HLA A2 BSP和 pBV2 2 0 β 2m原核表达载体 ,表达量分别占菌体的 4 6 %和 2 6 %左右 ;纯度达 90 %以上。构建的四聚体可成功的检测急、慢性乙型和丙型肝炎患者中特异性的CTL ,急性HBV感染时CTL占 1 84 % ,慢性HBV感染时CTL占0 0 2 %～ 0 6 8% ,慢性HCV感染的CTL占 0 0 2～ 0 72 %。结论　高效、稳定的pBV2 2 0 HLA A2 BSP和 pBV2 2 0 β 2m原核表达载体大量的表达可用于构建各种肽特异性的四聚体复合物 ;在体外构建的MHC Ⅰ类分子四聚体 ,为特异性细胞毒T细胞的检测提供有效的工具。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的：利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子（human brain-derived neurotrophic factor, hBDNF）的原核表达载体pBV220／mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法：制备重组质粒pGEM-T／hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果：重组原核表达质粒pBV220／mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论：成功构建了原核表达载体pBV220／mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的 :应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法 :将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV2 2 0 中构建筛选载体pBV2 2 3 ;根据氨基酸密码子的简并性 ,在保持原有氨基酸序列不变的情况下 ,人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库 ,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV2 2 3 中的TetR 上游位置 ,构建pBV2 2 3 /hGM CSF克隆文库 ,导入大肠杆菌DH5α中 ,构建转基因的细菌文库 ,在不同质量浓度 (2 0mg/L ,40mg/L ,5 0mg/L ,6 0mg/L)的四环素培养基中培养。结果 :从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV2 2 3 /hGM CSF克隆 ,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA 5′端序列与天然序列比较有 7个碱基发生突变 ,且符合实验设计的要求。通过基因重组 ,构建成最终的高效表达克隆pBV2 2 0 /hGM CSF ,其表达hGM CSF的量占细菌总量的 18% ,较原表达水平提高 80 %。结论 :可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。     

NK4蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化、复性及活性测定

目的 在大肠埃希菌(E. coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性.方法 采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E. coli BL21(DE3),温控诱导表达目的 蛋白NK4.蛋白鉴定采用SDS-PAG...     

p21waf1基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建人p21^waf1基因的原核表达载体并在大肠杆菌JM109中高效表达。方法:从人肝细胞中分离总RNA,经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到p21^waf1全基因。用原核细胞表达载体构建了pBV220/p21^waf1重组质粒,经DNA测序确认后,将其转化到大肠杆菌JM109进行表达、初步纯化。 结果:SDS-PAGE凝胶电泳分离显示在分子量21 000处有一诱导蛋白带,薄层扫描显示表达产物在诱导5 h时可达细菌总蛋白的38%,Western blotting证明表达产物与抗人P21^waf1单克隆抗体有特异性免疫反应。 结论:成功构建出p21^waf1表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为P21^waf1蛋白。     

血链球菌丙酮酸氧化酶基因表达克隆的构建与鉴定

目的　构建血链球菌丙酮酸氧化酶基因 Sopox的表达质粒 ,为研究丙酮酸氧化酶基因 Sopox表达的调节奠定基础。方法　将从血链球菌 ATCC10 5 5 7克隆的丙酮酸氧化酶基因 Sopox重组到 p BV2 2 0 ,表达载体 ,并转化入大肠杆菌 E.coli JM10 5 ,观察 Sopox基因在大肠杆菌中的表达。结果　通过酶切后电泳鉴定 ,Sopox基因重组入 p BV2 2 0并转化入 E.coli JM10 5 ;经 42℃诱导后 ,SDS- PAGE显示 p BV2 2 0 / Sopox/ JM10 5表达分子量约为6 5 kd的蛋白 ,与根据 Sopox基因 DNA序列预测的蛋白分子量一致 ;p BV2 2 0 / Sopox/ JM10 5的蛋白表达在 42℃诱导 4小时后达高峰。结论　丙酮酸氧化酶基因 Sopox已被成功地克隆到 p BV2 2 0 ,并在 E.coli JM10 5中表达     

甲/戊型肝炎重组抗原的表达、纯化及与传统甲肝疫苗免疫原性的比较

目的比较基因工程重组抗原与传统疫苗的免疫原性;探讨同一载体表达不同抗原的能力和抗原间的相互作用。方法将编码甲型肝炎病毒Vp1aa24-171和戊型肝炎病毒ORF2aa431-615的重组表达质粒pBV220-EAAg342及pBV220-AEAg342转化入大肠杆菌BL-21,筛选出高效表达的菌种进行目的蛋白的表达。用DEAE-sepharose FF和CM-sepharoseFF离子层析交换柱纯化表达重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting方法进行分析鉴定。用纯化的重组蛋白及传统甲肝疫苗灭活疫苗与减毒活疫苗免疫小鼠,比较特异性抗体的产生水平。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为36000,表达量约占菌体总量的25%;且重组嵌合抗原EAAg342可以形成直径10～20nm的类病毒(virus-like particles,VLP)颗粒。Western blotting证实2种重组蛋白均能分别与甲型肝炎和戊型肝炎患者阳性血清发生特异性反应。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的抗戊肝特异性抗体;而抗甲肝特异性抗体水平与传统甲肝疫苗相比较低。结论使用原核系统表达的甲/戊肝重组抗原能够高效表达,2种不同的融合蛋白均分别具有良好的抗原性和免疫原性,具有开发双价疫苗及同时诊断甲型戊型肝炎试剂盒的前景。