带核定位信号的维甲酸受体α 与Ubiquilin 1蛋白相互作用的验证

目的：验证带有核定位信号的维甲酸受体α（nuclear localization signal-retinoic acid receptor α, NLS-RARα）与Ubiquilin 1（UBQLN1）蛋白之间的相互作用。方法：将表达NLS-RARα诱饵蛋白和UBQLN1靶蛋白的两种重组表达质粒pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建真核细胞表达载体pCMV-HA-NLS-RARα 和pCMV-Myc-UBQLN1,经酶切鉴定后,共转染HEK293细胞,利用抗HA多克隆抗体沉淀,抗Myc单克隆抗体检测验证他们之间的相互作用。结果：pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;构建的重组表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-UBQLN1经酶切鉴定成功,转染HEK293细胞后,用免疫共沉淀技术检测到Myc-UBQLN1蛋白的表达。结论：酵母双杂交和免疫共沉淀技术可验证NLS-RARα与UBQLN1之间存在相互作用。     

带核定位信号的RARα与JTV1蛋白相互作用的验证实验

目的 通过实验验证带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)与JTV1蛋白之间的相互作用.方法 将表达NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白的两种重组表达质粒共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术在体外验证二者之间的相互作用.结果 NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行免疫印迹检测,可以检测到Myc-JTV1蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术验证了NLS-RARα与JTV1间存在相互作用.     

带核定位信号的RARα与谷氨酸氨连接酶蛋白相互作用的胞内外验证

目的通过胞内外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)之间的相互作用。方法将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白的两种重组表达质粒共同转化入AH109酵母菌,采用一对一的酵母双杂交技术验证它们在活细胞内的相互作用;通过构建GLUL及NLS-RARα蛋白标签融合表达载体,共转染至人胚肾HEK293细胞,利用免疫共沉淀技术在细胞外验证它们之间的相互作用。结果 GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色的阳性克隆;GLUL蛋白及NLS-RARα标签融合表达载体构建成功,共同转染至HEK293细胞,采用抗HA多克隆抗体免疫沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,抗c-Myc单克隆抗体免疫印迹检测,检测到GLUL-cMyc蛋白。结论采用酵母双杂交和免疫共沉淀技术成功地在胞内外验证了GLUL与NLS-RARα之间存在特异性的相互作用。     

利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用

目的 利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypothetical protein,HT036)和P311间的相互作用.方法 构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋白(Myc-P311)的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证HT036与P311间的相互作用.结果 构建的重组表达载体pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确,转染293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-P311相互作用蛋白复合物后,用抗HA单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到HA-HT036的表达.结论 成功构建了HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实HT036与P311之间存在着相互作用.     

Peroxiredoxin Ⅱ酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测

目的:应用酵母双杂交体系,构建人peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测该载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法:用PCR扩增PrxⅡ基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与pGBKT7载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;用醋酸锂法(Li-Ac)将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果:成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X--αgal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His/-Trp/X--αgal,SD/-Ade/-Trp/X--αgal平板上不能生长,两种酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD600均值均为0.9,说明AH109[pGBKT7-PrxⅡ]转化成功,对酵母菌株AH109无毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论:成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。     

突变的SOD1 cDNA与人MAP/MARK1片段在人胚肾293细胞中的相互作用

目的用酵母双杂交方法显示突变的SOD1 cDNA与人MAP／MARK1的片段结合，进一步探讨二者能否在哺乳动物表达系统人胚肾293细胞中发生相互作用，以验证酵母双杂交的结果。方法采用PCR方法及双酶切的方法构建含突变SOD1 cDNA片段的真核表达质粒pCMV-Myc和含人MAP／MARK1的片段真核表达质粒pCMV-HA，分别或共同转染人胚肾293细胞，进行免疫共沉淀检测。结果免疫共沉淀结果表明，重组含突变的SOD1 cDNA质粒pCMV-Myc分别与空载体pCMV-Myc、pCMV-HA共转染，免疫沉淀物中均未检测到结合蛋白，只有重组含突变SOD1 cDNA真核表达质粒pCMV-Myc与重组含人MAP／MARK1的片段真核表达质粒pCMV-HA共转染时，在免疫沉淀物中能检测到结合蛋白，表现在蛋白免疫印迹上有特异性目的条带。结论突变的SOD1 cDNA与人MAP／MARK1片段在人胚肾293细胞中存在蛋白水平的相互作用。     

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得COPS3基因片段，其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。     

硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ诱饵质粒的构建和检测

目的 构建硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)诱饵质粒,同时检测其在酵母菌内的表达和对酵母细胞的毒性.方法 提取人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的RNA,利用RT-PCR获得其cDNA, PCR方法扩增PrxⅡ基因片段,纯化后以内切酶双酶切PrxⅡ和酵母表达载体pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为pGBKT7-PrxⅡ, 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用.结果 构建的诱饵载体pGBKT7-PrxⅡ测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.将pGBKT7-PrxⅡ成功转化入酵母感受态AH109,并证明PrxⅡ蛋白对酵母无毒性作用.结论 证实了PrxⅡ蛋白无酵母毒性,诱饵质粒pGBKT7-PrxⅡ可以用于酵母双杂交研究前列腺癌发病机制.     

HCV核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的: 检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法: PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中. 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段,HCV核心蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用. 结论: 利用酵母双杂交Gal4系统3研究与HCV核心蛋白相互作用的蛋白,证实了HCV核心蛋白无自激活功能.     

CD14与TLR4相互作用的实验研究

目的探讨CD14与TLR4(toll-like receptor 4, TLR4)在介导LPS膜信号转导中的相互作用.方法通过PCR分别克隆CD14 cDNA和TLR4胞外区cDNA,构建其酵母表达载体,将载体共转化酵母细胞行酵母双杂交实验.同时,应用Pull-down和免疫共沉淀实验在体外及体内进一步鉴定CD14与TLR4的相互作用.结果 PCR扩增获得了CD14 cDNA和TLR4胞外区cDNA,并成功地构建了pGADT7 AD-CD14和pGBKT7 BD-TLR4酵母双杂交质粒.酵母双杂交系统检测显示pGADT7 AD-CD14和pGBKT7 BD-TLR4质粒均无自主激活报告基因LacZ表达的能力,在酵母细胞中CD14和TLR4之间存在相互作用.Pull-down结果也显示,在体外反应体系中,CD14和TLR4间存在相互作用.免疫共沉淀实验结果表明,在哺乳动物细胞(HEK 293)这一体内反应体系中,CD14与TLR4间也存在交互作用.结论在酵母细胞、体外反应体系和哺乳动物细胞(HEK 293)中,CD14与TLR4之间存在物理上的相互作用.     

NLS-RARα与ISCA1相互作用在哺乳动物细胞中的验证

目的：利用免疫共沉淀和蛋白质印记技术验证铁硫簇组装蛋白1（ISCA1）与带核定位信号的维甲酸受体α（NLS—RARα）蛋白间的相互作用．方法：构建含融合蛋白的真核表达载体pCMV—HA—NLS—RARα和pCMV—Myc—ISCA1,酶切及测序鉴定正确后,转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀和蛋白质印记技术进一步证实二者之间的相互作用．结果：真核表达载体成功构建并经测序鉴定,转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA—NLS—RARer相互作用蛋白复合物后,用抗MycmAb进行蛋白印记检测,可以检测到Myc-ISCA1蛋白的表达．结论：分别成功构建了含HA—NLS—RARer与Myc—ISCA1融合蛋白的真核表达载体,并利用免疫共沉淀和蛋白质印记技术在体外证实了NLS—RARα与ISCA1之间存在相互作用．     

免疫共沉淀-蛋白测序技术验证Periostin和SFRP2之间的相互作用

目的 验证凋亡相关蛋白基因SFRP2(secreted frizzled-related protein 2)和骨母细胞特异性因子-2 Periostin(osteoblast-specific factor 2)间的相互作用.方法 分别构建重组载体pCMV-Myc-SFRP2和pCMV-HA-Periostin经双酶切鉴定正确,共转染HEK293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-SFRfr2相互作用蛋白复合物后,进行SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色,切下目的条带,利用HPLC-Chip/MS纳流液质联用技术进行肽序列分析,经Spectrum Mill搜索Swissport数据库后鉴定蛋白质.结果 经HPLC-Chip/MS纳流液质联用技术分析,免疫沉淀复合物内可检测出Periostin的表达.结论 Peri-ostin与SFRP2间存在相互作用.     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

Construction of recombinant plasmid pEGFP-C2-L539fs/47and its expression in HEK293 cells

Objective:To reconstruct pEGFP-C2-L539fs/47,a HERG nonsense mutant in eukaryotic expression plasmid,and observe the fusion protein expressed in HEK293 cells (human embryo kidney cells).Methods:After double digestion of pcDNA3-L539fs/47 and pEGFP-C2-HERG with sbf I and Eco91 I,the small product fragment,from pcDNA3-L539fs/47,was subcloned into the big fragment of pEGFP-C2-HERG under T4 ligase.pEGFP-C2-L539fs/47 was identified by agarose gel electrophoresis and sequencing.pcDNA3-L539fs/47 and pEGFP-C2-L539fs/47 were transiently transfected into HEK293 cells by Lipofect,respectively.The expression of fusion protein in HEK293 cells was detected through immunofluoresceoce,laser confocal imaging scanning in vivo,Western blot and PCR.Results:Mutation region cDNA fragment (about 1 kb) and target vector fragment (about 7.2 kb) were ligated after purification and gel recovery.Agarose gel electrophoresis and sequencing successfully demonstrated eukaryotic expression plasmid pEGFP-C2-L539fs/47,constructed approximately 8.2 kb,sequencing consistent with template geue.The transfection efficiency of recombinant plasmid by fluorescence microscopy was more than60％.Western blot analysis detected pcDNA3-L539fs/47 expression of the protein size 60 KD,the expression of pEGFP-C2 fusion protein size of approximately 90 KD.The L539fs/47 gene expression in HEK293 ceils was significant by PCR analysis.Confocal laser imaging showed that pEGFp-C2-L539fs/47 protein was successfully expressed in cytoplasm and cytomembrane of HEK293 cells.Conclusion:pEGFP-C2-L539fs/47 containing the HERG gene mutant was successfully constructed by double digestion method and expressed fusion protein in HEK293 cells,which laid a foundation for the further study on L539fs/47.     

GST Pulldown技术检测HEK293T细胞活化的Rab35

目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中活化的Rab35的可靠检测方法?方法:构建GST-RUN的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21中大量表达?用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Rab35及Rab35蛋白的表达?结果:成功构建了GST-RUN的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RUN,用GST Pulldown和Western blot技术证实了HEK293T细胞中有活化的Rab35和Rab35总蛋白的表达?结论:本工作所建立的GST Pulldown技术可以检测HEK293T细胞中活化的Rab35,从而为进一步深入研究Rab35在真核细胞中的功能提供了技术保障?