严重胸部创伤复合内毒素感染对肺泡与肺间质巨噬细胞吞噬功能的影响

目的 :观察正常大鼠肺泡与肺间质巨噬细胞吞噬功能的差异 ,比较两种细胞对严重胸部创伤、创伤复合内毒素感染的不同反应性。方法 :采用胸部撞击伤模型 ,造成动物严重胸部致伤 ;分离、纯化动物肺泡和肺间质巨噬细胞 ,检测两种细胞创伤前和创伤后 2、4、8、16和 2 4 h吞噬功能的动态变化。结果 :创伤早期 (2和 4 h)巨噬细胞吞噬功能增强 ,随后下降 ;肺泡巨噬细胞吞噬功能在创伤前后各时间点均显著强于间质巨噬细胞(P均 <0 .0 1) ;复合内毒素感染后 ,肺泡巨噬细胞吞噬功能未受影响 ,但间质巨噬细胞的吞噬能力进一步增强。结论 :肺泡和间质巨噬细胞具有功能异质性 ,而且两种细胞亚群对创伤及复合内毒素感染的反应性不同 ,提示两者在创伤后机体免疫功能紊乱中的地位不同。     

急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4的表达及意义

目的 观察严重胸部创伤致急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达水平的变化,并探讨其意义。方法 建立严重胸部创伤致急性肺损伤模型。肺组织机械剪碎,然后用胶原酶、DNA酶消化肺组织,分离、培养肺间质巨噬细胞,利用免疫印迹蛋白、Northern Blot等分子生物学技术检测创伤前以及创伤后2、4、8、16和24 h肺泡巨噬细胞TLR4蛋白及基因表达。结果 利用小型多功能生物撞击机以400 kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤,能够建立稳定可靠并且符合临床特点的严重胸部创伤模型;严重胸部创伤可以上调TLR4蛋白及基因在肺间质巨噬细胞内的表达,表达高峰在伤后8和16 h,伤后24 h恢复正常。结论 TLR4的上调参与了创伤后失控性炎症反应的病理生理过程。     

SELEX技术筛选入rhTGF—βsRⅡ亲和核酸库方法的建立

目的建立SELEX技术筛选rhTGF-βsRⅡ单链DNA亲和核酸库的方法，为后续分离rhTGF-βsRⅡ的单一核酸适体奠定基础。方法体外构建了一个长度为108nt、含60个随机核苷酸序列的ssDNA随机库。将靶蛋白rhTGF-βsRⅡ预先吸附到固相栽体Phenyl-Agarose上，再与ssDNA随机库温育，洗脱未结合核酸片段，回收与rhTGF-βsRⅡ结合的ssDNA。行PCR扩增时，采用5’端生物素化的下游引物，使PCR产物偶联上生物素。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物。利用Immobilized Streptavidjrr-Agarose捕获dsDNA，0．15N的NaOH使双链变性，释放非生物素标记的ssDNA，回收后用于下一轮筛选。随着筛选的进行，严谨度不断增加。结果经过8轮筛选后，富集库对靶蛋白的亲和力从0.76％上升到17.18％。结论成功建立了SELEX技术筛选rhTGF-βsRⅡ亲和核酸库的方法。     

SELEX实验中两种富集方法的比较

比较指数富集系统进化配体 (SELEX)实验中 ,液相筛选与固 液相筛选方法的差异对筛选富集库亲和力的影响。液相筛选、膜截留结合核酸的技术路线与固 液相筛选、固相中直接获取结合核酸的途径相比较 ,前一种方法更容易富集到与靶目标结合的目的序列。     

创伤患者外周血单核细胞表型及趋化活性的研究

目的：探讨创伤病灶炎细胞积聚的分子机制,为控制创伤后炎症反应提供实验依据。方法：损伤程度评分（ＩＳＳ）≥１６分的创伤患者２０例,健康对照组１０例,用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测伤后不同时间外周血浆巨噬细胞炎症蛋白－１α（ＭＩＰ－１α）的表达水平,用Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｑａｐｕｅ梯度离心法和粘附法分离纯化单核细胞,用Ｂｏｙｄｅｎ小室法趋化实验,用流式细胞术分析单核细胞ＣＤ８６和ＣＤ６４的表达情况．     

NF-κB p50和p65蛋白保守结构域原核表达系统的建立

目的 为了获得具有DNA结合活性的人NF—κB p50和p65蛋白,建立人NF-κB p50和p65蛋白保守结构域的原核表达系统。方法 通过PCR法扩增获得人NF-κB p50和p65蛋白保守结构域的cDNA,后分别将其克隆到原核表达载体pET-22b( )上,转化E．coli BL-21,经诱导表达及包涵体的变性和复性处理,获得可溶性p50和p65,同时用Western—Blot鉴定NF-κB p50和p65蛋白的表达,EMSA实验检测NF-κB p50和p65蛋白的DNA结合活性。结果 构建了pET-22b／p50和pET-22b／p65原核表达质粒;p50、p65蛋白在大肠杆菌中的表达均为包涵体;变性、复性后得到了可溶性p50和p65蛋白,浓度达218μg／ml和158μg／ml;并证实可溶性p50和p65蛋白均具有DNA结合活性。结论 成功建立了pET-22b／p50和pET-22b／p65原核表达系统,获得了具有DNA结合活性的NF-κB p50和p65蛋白。     

创伤患者单核细胞人类白细胞抗原DR的表达及其对感染并发症的预测价值

目的 探讨创伤患者单核细胞人类白细胞抗原DR(HLA-DR)抗原分子的表达变化规律，及其对伤后感染并发症的预测价值。方法 应用流式细胞仪连续监测54例创伤患者伤后单核细胞HLA-DR抗原分子的表达，并根据创伤严重程度分组进行分析。另对34例严重创伤患者，根据其感染发生与否及严重程度分组进行分析。结果 创伤患者伤后单核细胞表达HLA-DR的阳性细胞率和平均荧光强度均出现降低，以伤后2d达到低谷，之后逐渐恢复；与健康对照相比，中度和重度创伤患者单核细胞HLA-DR抗原分子出现明显的低表达；轻度创伤患者与健康对照相比，重度与中度创伤患者相比，HLA-DR的表达变化均无明显的差异。另外，严重创伤患者单核细胞HLA-DR的表达变化与感染并发症发生与否及严重程度有明显的相关性；非感染患者伤后2d单核细胞HLA-DR的表达降到最低，随后逐渐恢复正常；局部感染患者伤后前4d单核细胞HLA-DR的表达明显低于非感染患者，6d后逐渐恢复正常；并发全身感染患者，伤后单核细胞HLA-DR的表达阳性细胞率于伤后1～14d，平均荧光强度于伤后2～14d均明显低于局部感染患者。死亡的2例患者，单核细胞HLA-DR的表达持续低下直至死亡。结论 严重创伤患者单核细胞HLA-DR分子表达量明显降低，且HLA-DR的表达变化与患者感染并发症的发生、发展及预后有明显的关系。     

内毒素攻击对大鼠肺泡及间质巨噬细胞的功能影响

目的观察正常大鼠肺泡与间质巨噬细胞形态结构差异以及内毒素攻击对它们的不同影响.方法支气管肺泡灌洗获取肺泡巨噬细胞,肺组织机械处理结合酶消化法(DNA酶、胶原酶)分离间质巨噬细胞;电镜下比较两种细胞的形态、结构差异,并以无色孔雀绿显色法比较两种细胞吞噬功能以及LPS攻击对它们的不同影响.结果肺内两个巨噬细胞亚群在形态、结构上有明显不同;在功能上,肺泡巨噬细胞的吞噬能力显著强于间质巨噬细胞,体外复合LPS攻击能明显增强间质巨噬细胞的吞噬能力,而肺泡巨噬细胞未受影响.结论肺内两个巨噬细胞亚群间存在异质性,肺间质巨噬细胞不应被单纯看作是肺泡巨噬细胞的前体细胞.     

人类髓样分化蛋白-2的原核表达

目的：在大肠杆菌DH-5α中表达人类髓样分化蛋白-2(human myeloid differentiaton protein-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-s-transferase,GST)的融合蛋白(GST／hMD-2),并对融合蛋白进行免疫学鉴定及初步的变性复性处理．方法：建立GST／hMD-2表达菌,在不同温度下以不同浓度IPTG诱导不同时间后采样,用SDS-PAGE分析各种组合条件下融合蛋白的表达量和溶解性;用Western-Blot鉴定融合蛋白免疫性;用尿素变性和透析法对融合蛋白进行初步纯化．结果：在37℃经0．4mmol/L IPTG诱导4h后,GST／hMD-2可获最高表达量(约占菌体总蛋白的20％),未见可溶性表达;Western-Blot证实GST／hMD-2能与抗MD-2单克隆抗体特异性结合;GST／hMD-2溶于8mol/L尿素,梯度透析后纯度提高至40％．结论：hMD-2可在大肠杆菌DH-5α中与GST融合表达．