人截断型转化生长因子β受体Ⅱ真核表达载体的构建和表达

目的构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体（△TβRⅡ）的真核表达载体pEGFP／△TβRⅡ，转染L02细胞以表达融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，并检测其生物学活性。方法以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体（TpRⅡ）胞外段和跨膜段的cDNA，将该cDNA克隆到真核表达载体pEGFP-N2上，构建成pEGFP／△TβRⅡ重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定，将该重组质粒转染L02细胞，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白EGFP的表达，并检测其生物学活性。结果L02细胞转染pEGFP／△TβRⅡ重组质粒后，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP的表达，所表达的蛋白能显著减轻TGF-β1对L02细胞G1～S期的阻滞作用。结论成功构建了pEGFP／△TβRⅡ重组质粒，并表达了有活性的融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，为进一步探讨其生物学效应奠定了基础。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达

目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体（EGFP）的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中，获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实，pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。     

鼠伯氏疟原虫CSP基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

目的分别构建携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)环子孢子(CSP)全长基因和去除中央重复序列的CSP的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在Hela细胞中的表达。方法采用PCR技术,从伯氏疟原虫基因组中扩增全长CSP基因,将其定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP全长基因重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定;同样,采用PCR技术扩增PbCSP的N端和C端两个片段,先将C端片段定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP-C重组质粒,再将PbCSPN端片段定向克隆入pEGFP/PbCSP-C,构建pEGFP/PbCSP'重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定。将pEGFP/PbCSP和pEGFP/PbCSP′分别用脂质体介导转染体外培养的Hela细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测融合蛋白的表达。结果PCR、酶切及测序证实目的基因PbCSP全长和片段分别正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,两种重组质粒转染Hela后,荧光显微镜及RT-PCR均检测到目的蛋白在Hela中表达。结论成功构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫CSP全长基因和该基因片段的融合蛋白真核表达质粒,并在Hela细胞中获得表达。     

pEGFP-C2-GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达

目的：构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP—C2-GATA4，并检验其在P19细胞中的瞬时表达．方法：以真核表达质粒pEFSA—GATA4为模板，PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段，将目的片段亚克隆到pEG—FP—C2载体，卡那霉素筛选阳性克隆，经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定．将重组质粒pEGFP—C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞，用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达．结果：酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP—C2载体，并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4-EGFP融合蛋白表达．结论：成功构建真核表达质粒pEGFP—C2-GATA4，并在P19细胞瞬时表达成功，为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础．     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子（HIF-1α）真核表达载体，为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法 采用分子克隆技术，KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3．1／V5-Hin—HIF-1仅获得HIF-1仅cDNA，克隆到质粒pcDNA3．1（＋），得到质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1α，以KpnⅠ，ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1仅获得HIF-1α cDNA，克隆到质粒pEGFP—c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞，用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α 在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功。荧光显微镜和Westom blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP—HIF-1α—c1并在HEK293细胞表达，为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。     

优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白基因的设计合成与表达

目的：设计合成优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP）基因，克隆构建优化密码MOMP(HuMOMP)基因的真核表达质粒及EGFP—HuMOMP融合基因表达质粒。方法：利用软件分析比较鼠肺炎沙眼衣原体(MoPn)与人类等哺乳动物基因组密码子使用的差异，根据所得数据对MOMP基因进行优化设计与合成。双酶切pUC—HuMOMP质粒，游离HuMOMP片段，定向克隆入pcDNA3的相应位点，构建重组真核表达质粒pcDNA3-HuMOMP；双酶切游离pcDNA3-HuMOMP中的HuMOMP片段，定向克隆入pEGFP—Cl的相应位点，构建重组真核表达质粒pEGFP—HuMOMP；pEGFP-HuMOMP质粒体外脂质体转染COS—1细胞，24h后观察荧光蛋白的表达。结果：合成的HuMOMP基因全长1125bp，经DNA测序无误。酶切鉴定pcDNA3-HuMOMP及pEGFP—HuMOMP质粒获得预期分子量DNA片段：EGFP—HuMOMP融合基因在COS—1细胞中获得明显表达，表达产物定位于胞浆。结论：设计合成的优化密码HuMOMP基因能够在哺乳动物细胞中成功表达。     

hVEGF165和嵌合水蛭肽融合基因的真核表达载体的构建及其表达

目的:克隆hVEGF165和嵌合水蛭肽(fused hirudin,FH)融合基因,构建hVEGF165-FH/pcDNA3.0基因表达载体,并在人内皮细胞株中表达.方法:分别通过PCR法扩增hVEGF165和引物退火法合成FH基因,将融合基因插入表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0.对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析,将正确克隆的质粒分别作体外快速转录翻译鉴定,以及经脂质体介导转染人内皮细胞株,并对表达产物进行鉴定.结果:hVEGF165和FH成功融合,形成711 bp的目的片段,并成功构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0,重组质粒转染人内皮细胞株有hVEGF165-FH表达.结论:重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0在人内皮细胞株中得到表达,为其融合蛋白活性研究及基因治疗打下良好基础.     

人VEGF166基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF166质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响。结果FITC标记剂豆凝集素I和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2FLk-1和VIII因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF166,VEGF165转染EPCs的转染率约22．5％;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础。     

过表达Periostin蛋白对内皮前体细胞功能影响的实验研究

目的构建Periostin蛋白过表达慢病毒载体, 并检测其对内皮前体细胞(EPCs)功能的影响。方法从小鼠骨髓中获取EPCs, 并进行鉴定。采用Oligos设计获得目的基因, 构建慢病毒载体LV5/Periostin。慢病毒感染EPCs, 荧光显微镜下观察被感染细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况, Western blotting检测Periostin蛋白表达情况。CCK-8法和流式细胞计数检测被感染细胞的增殖和凋亡情况, 划痕法和Transwell小室法检测被感染细胞迁移和侵袭能力的改变情况。结果被重组慢病毒感染的EPCs明显表达GFP; 过表达慢病毒组细胞增殖活性较阴性对照组低, 而凋亡细胞较阴性对照组多(P < 0.05);过表达慢病毒组细胞的迁移率较空白对照组细胞高, 侵袭细胞数目较多(P < 0.05)。结论可以从小鼠骨髓中成功分离和培养EPCs, 过表达Periostin蛋白会降低EPCs体外增殖的活性, 促进其凋亡; 但会增加EPCs的体外迁移和侵袭能力。     

nox5表达异常对缺血性心肌病患者循环EPCs功能的影响

目的探查缺血性心肌病患者循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能是否异常,了解活性氧(reac-tive oxygen species,ROS)和ROS生成的相关基因nox5表达对EPCs功能的影响。方法入选缺血性心肌病患者及健康对照组各7例,测定外周血EPCs数量、增殖、迁移、成血管能力的改变,检测nox5蛋白及mRNA的表达,进一步沉默nox5表达,检测对EPCs功能及ROS产量的影响。结果与健康对照组比较,缺血性心肌病患者循环EPCs数目、增殖、迁移能力等未见异常;但体外培养过程中内皮系表面标志KDR的表达减少,体外成血管能力下降,伴随nox5蛋白及mRNA表达增加、活性氧生成增加;沉默nox5表达可降低细胞内ROS产量,改善EPCs成血管能力。结论本研究提示,缺血性心肌病患者循环EPCs体外成血管能力异常,细胞内ROS生成增加,ROS生成的相关基因nox5蛋白及mRNA表达上调;沉默nox5表达可降低细胞内ROS产量并改善EPCs功能。     

结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达。方法：用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以Hindm和EcoR Ⅰ双酶切后克隆人含esat6基因的pGEM-7zf( )载体中,将测序正确的esat6-cfp10融合基因按照BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( ),重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT—PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达．结果：PCR获得的cfp10基因序列与献报道一致,大小约为350bp．重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合esat6-cfp10基因片段．RT—PCR可获得大小约为350bp的诉CFP10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6-Cfp10蛋白的阳性细胞着染．结论：成功克隆结核分枝杆菌CFP10基因,构建了融合有esat6-cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达。     

人cbl 基因真核表达载体的构建及表达

目的: 构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达.方法: 以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl 为模板,采用PCR方法扩增cbl基因,并在其N-末端带上含24 bp的flag标签,克隆到pGEM-T easy载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-cbl在细胞中的表达. 结果: 测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flag-cbl融合基因的序列以及读框全部正确;重组质粒pcDNA3.1( )-flag-cbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.结论: 成功构建了N-末端带flag标签的cbl真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.     

eNOS基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓来源内皮祖细胞中的表达分析

目的探讨eNOS基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPCs）中的表达与作用。方法将eNOS基因插入载体PSUCMV中构建重组质粒PSUCMVeNOS,经酶切、插入、转染后包装扩增成腺病毒颗粒;大鼠胫骨获取骨髓,制备EPCs,鉴定正确后传代纯化,将三代细胞随机分为PBS对照组（C组）、Lac基因转染组（L组）和eNOS基因转染组（N组）。分别于干预后第1天、第3天、第7天观察各组细胞形态的变化,检测培养液中NO含量和各组细胞eNOS表达的变化。结果AdCMVeNOS病毒DNA成功包装成完整的病毒颗粒,测其滴度为1．58×10^10 PFU／mL;将其转染鉴定正确的EPCs,结果于体外转染后1d内,即可检测到eNOS转基因产物的表达增加;N组同一时点eNOS含量明显高于L组、C组,组间比较差异显著;组内比较,N7、N3与N1组比较差异显著。随时间延长NO生成量递增,第3天与第7天结果差异有显著性。结论eNOS基因可在大鼠EPCs中高效表达,并可促使培养液中NO含量明显增高。     

腺相关病毒介导的人血管内皮生长因子体外转染兔骨髓内皮祖细胞

目的:探讨腺相关病毒-2(AAV-2)介导人血管内皮生长因子-165(hVEGF165)转染兔骨髓内皮祖细胞(EPCs)及其对EPCs增殖能力的影响。方法:构建携带hVEGF165基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体pAAV-hVEGF165;制备携带hVEGF165基因的rAAV(rAAV-2-hVEGF165)和携带β-半乳糖苷酶(-βgal)基因的rAAV(rAAV-2-LacZ);体外培养和鉴定兔骨髓EPCs;分别用rAAV-2-hVEGF165和rAAV-2-LacZ体外转染EPCs(AAV/VEGF-EPC和AAV/LacZ-EPC);用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术等法检测hVEGF165和-βgal的表达,MTT法检测AAV/VEGF-EPC的增殖能力。结果:经酶切鉴定和DNA测序,得到了序列正确的重组质粒pAAV-hVEGF165;AAV/VEGF-EPC能够表达hVEGF165蛋白,AAV/LacZ-EPC能够表达-βgal;rAAV-2-hVEGF165对于EPCs的转染率为64.4%;AAV/VEGF-EPC的增殖能力明显强于AAV/LacZ-EPC和EPCs。结论:EPCs可以被rAAV-2-hVEGF165高效转染,其增殖能力明显增强。本文为进一步探讨AAV/VEGF-EPC用于缺血性血管疾病治疗的可能性奠定了基础。     

百里醌对内皮祖细胞的抑制作用

目的探讨百里醌对人脐血来源的内皮祖细胞血管生成的抑制作用及其可能机制。方法采用贴壁选择法培养人脐血内皮祖细胞(EPCs),DiI-ac-LDL吞噬试验及VEGFR-2、Ⅷ因子和CD34细胞免疫组化证实细胞属性;百里醌作用EPCs后,CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室实验测定EPCs体外侵袭能力;小管形成实验检测EPCs体外小管形成能力;Western blotting检测EPCs中MMP-2和MMP-9蛋白表达。结果体外成功培养出人脐血内皮祖细胞,百里醌可显著抑制体外EPCs增殖,IC50=51.2nmol/L;百里醌可抑制体外EPCs侵袭和小管形成,呈浓度依赖性;百里醌可显著下调EPCs中MMP-2和MMP-9的表达。结论百里醌可能通过抑制EPCs中MMP-2和MMP-9的表达从而抑制EPCs参与的血管生长,从而有望作为有效的血管生成抑制药物。