胚肝细胞中树突状细胞的分离、培养和表型鉴定

本实验主要以胚肝细胞作为细胞来源，通过贴壁处理，分离DCs的前体细胞，在含细胞因子的培养体系中培养，诱导其分化为树突状细胞。比较不同处理和不同来源细胞所得到的树突状细胞生长状况、细胞表型和异同、细胞功能，以寻找一种体外大量扩增人树突状细胞的新方法．     

大鼠骨髓来源树突状细胞的体外培养与鉴定

目的建立体外培养、诱导和扩增大鼠骨髓来源的树突状细胞的方法。方法实验通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合,培养、诱导和扩增大鼠骨髓来源的树突状细胞,通过形态学和免疫表型进行鉴定。结果成功建立了体外大量培养、诱导及扩增大鼠骨髓来源树突状细胞的方法;经倒置相差显微镜、透射电镜及流式细胞仪鉴定,证实所培养细胞为树突状细胞。结论通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合能培养、诱导、扩增大量的树突状细胞。     

不同来源人树突状细胞的培养诱导及鉴定

目的通过对不同来源的人树突状细胞的体外培养与诱导,建立树突状细胞的稳定体系,为更进一步实验打好基础。方法分离人外周血单个核细胞(PBMC),用不同树突状细胞亚群的特异性表面标记抗体磁珠分离树突状细胞前体,通过加入不同的刺激分子,分别诱导未成熟、成熟及活化等不同阶段的树突状细胞。结果与未成熟树突状细胞相比,成熟活化型树突状细胞表达HLA-DR、CD86以及CD40等共刺激分子明显升高,其中MoDC对成熟标记物CD83的表达水平亦较高。此外,两者在形态上也有明显的差异。结论通过对不同亚群树突状细胞的体外诱导、培养和鉴定,建立了较为成熟的研究树突状细胞的平台,为深入开展工作打下基础。     

HER2阳性乳腺癌细胞株上清液对树突状细胞表型及功能的影响

目的探讨人HER2阳性乳腺癌细胞对树突状细胞表型及功能的影响。方法分离培养外周血单个核细胞来源的树突状细胞。培养的第5天,实验组HER2’MCF-7细胞的培养上清液孵育24小时,以不加上清液的树突状细胞作为对照组,流式细胞术检测树突状细胞表面标志CDS0、CD86、CD40、CD83和HLA—DR的表达水平,ELISA法检测树突状细胞细胞因子IL-12、TNF—α、IL-6和IL-10的分泌水平。用改良的MTT比色法检测上清液处理的树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力和ELISA法检测树突状细胞刺激T细胞分泌细胞因子的能力。结果树突状细胞与HER2’MCF-7细胞的上清液共培养后,树突状细胞表面分子CD80、CD83、CD86及CD40均表达升高,同时伴随着IL-12、TNF-α、IL-6的分泌增加。与对照组相比较,上清液处理的树突状细胞对激活同种异体T细胞增殖和分泌细胞因子的能力明显增强（P〈0．01）。结论HER2’MCF-7细胞能改善树突状细胞的抗原递呈功能和刺激T细胞活化增殖的能力,提示HER2’MCF-7细胞对树突状细胞是免疫刺激作用,对于HER2’的乳腺癌可采用基于树突状细胞疫苗的免疫治疗。     

Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定

目的：探讨体外分离、培养和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的有效方法。方法：采用改良的Chen－WoanDC培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM CSF 5?ng/ml、IL 4 5?ng/ml进行诱导扩增，对培养的目的细胞进行形态学、OX62－FITC免疫荧光检查以及功能学鉴定。结果：DC前体细胞培养10?d呈典型树突状结构，表面标志物染色阳性，流式细胞学检查OX62单抗阳性率86％，不同培养时段的DC诱发混合淋巴细胞反应以培养10?d的DC最强，培养10?d的DC诱发混合淋巴细胞反应对同源淋巴细胞有更好的活性。结论：改良的Chen－Woan法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源DC的有效方法。     

豚鼠树突状细胞的诱导与特性分析

目的建立能从豚鼠骨髓单核细胞中获得大量、具有抗原提呈功能的树突状细胞的方法。方法通过运用骨髓细胞培养的方法,以重组粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)协同诱导、培养和扩增豚鼠骨髓来源的树突状细胞,通过形态学和免疫表型进行鉴定,同时利用卡介苗(BCG)诱导树突状细胞后进行细胞凋亡的分析。结果在倒置显微镜下观察,培养7~14d后,细胞表面突起增多、分支较多,呈蔓状分布于细胞表面,形似树枝状,呈现典型的树突状细胞形态;免疫细胞化学检测经GM-CSF和IL-4诱导分化培养的豚鼠树突状细胞CD14阳性;流式细胞仪结合Annexin V-FITC标记法检测发现,BCG与树突状细胞混合培养24h后,细胞凋亡率为18.95%,显著高于对照组4.3%。结论成功建立了体外大量培养、诱导及扩增豚鼠骨髓来源树突状细胞的方法;经倒置相差显微镜、荧光显微镜及流式细胞仪鉴定,证实所培养细胞为树突状细胞。     

吗啡持续刺激对小鼠树突状细胞发育及分泌IL-12的影响

目的 吗啡持续刺激对C57BL/6小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟的影响.方法 体外培养C57BL/6小鼠骨髓来源的树突状细胞,培养过程中给予吗啡刺激,观察细胞形态的变化;应用酶联免疫吸附法检测树突状细胞分泌细胞因子IL-12水平的变化.结果 吗啡干预各组树突状细胞中细胞因子IL-12分泌水平较对照组显著升高.结论 吗啡持...     

人慢性髓性白血病细胞系来源的树突状细胞免疫功能的体外研究

目的：探讨人慢性髓系白血病K-562来源的树突状细胞的免疫功能。方法：用细胞因子粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL4在体外诱导培养K-562细胞，获得树突状细胞(DC)检测其细胞表型，并观察其诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外抗肿瘤效应。用ELISA法测定DC培养及DC与外周血单个核细胞共培养上清液中IL-12及IFN-γ的量。结果：联合GM-CSF及IL-4可诱导K-562细胞分化为树突状细胞，K-562DC体外激活的CTL对K-562细胞具有特异性细胞毒活性；诱导DC培养上清及DC与外周血单个核细胞共培养上清测出一定量IL-12及IFN-β。结论：人慢性髓系白血病K-562来源的树突状细胞表达抗原提呈细胞表型，具有诱导CTL反应和分泌IL—12以及促进T细胞分泌IFN-γ的作用。     

肝移植受体术后外周血来源树突状细胞乙肝表面抗原提呈功能检测

目的 了解处于乙肝病毒临床清除状态的肝移植受体术后外周血来源树突状细胞提呈乙肝病毒表面抗原的能力及其影响因素.方法 选取18例术后肝移植受体为病例组,6例健康成人为对照组,以细胞因子诱导法从外周血获得树突状细胞,经乙肝病毒表面抗原处理后进行混合淋巴细胞培养,检测并比较两组树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的能力,并进行多因素分析.结果 肝移植受体术后外周血来源的树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的能力弱于健康对照组(cpm值4310.8±1820.3 vs 19002.5±3357.8,P＜0.001),提呈乙肝病毒表面抗原的能力弱于健康对照组(cpm值4974.9±2414.7 vs 39258.4±5554.9,P＜0.001).结论 肝移植受体术后外周血来源树突状细胞提呈乙肝表面抗原的能力低下,此种功能缺陷可能是导致受体针对乙肝病毒的主动免疫反应性低的重要原因,并且其提呈作用受术前乙肝病毒复制状态、术后时间、术后预防方案及术后外周血单个核细胞乙肝病毒含量影响.     

慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞的功能研究

目的 比较慢性乙型肝炎病人外周血及正常人外周血两种来源的树突状细胞(dendritic cell，DC)表型及功能上的差异。方法 从慢性乙型肝炎病人及正常人外周血分离单个核细胞，在含有粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)白细胞介素4(IL-4)肿瘤坏死因子α(NFFα)的无血清培养基AVI-M中培养。流式细胞仪检测其表型，并采用MLR方法检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果 慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞经诱导可获得成熟的树突状细胞，但CD80表达较正常人低，刺激同种异体T细胞增殖能力低于正常人。结论 慢性乙型肝炎病人的外周血来源的树突状细胞的功能较正常人低。     

外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定

目的：以实体瘤患外周造血干细胞（PBSC）为来源，建立体外诱导扩增树突状细胞（DC）的方法，工进行表型鉴定及功能检测。方法：以血细胞分离机分离经动员的外周造血干细胞，加入rhGM-CSF,rhIL-4和nrhTfNF-α培养7－9d成为树突状细胞，进行细胞形态学、表型及刺激T细胞增殖能力分析。结果：PBSC经诱导培养后，倒置显微镜和电镜显示典型的树突状细胞形态和超微结构；流式细胞术分析显示细胞表面抗原高表达，其中CD1a 38.28%,CD11c 66.77%,共刺激分子CD80和CD86分别为51．05％，67．58％，MHCⅡ类分子HLA－DR为72．09％，为典型的DC表型特征，同种混合淋巴细胞反应结果显示DC具有高效的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力。结论：实体瘤患PBSC可成功诱导为具有典型形态特征及功能的树突状细胞。     

超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染树突状细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染外周血来源的树突状细胞的有效性及最佳的超声辐照参数.方法 体外培养树突状细胞,在不同的超声波强度、机械指数、照射时间及不同的超声微泡造影剂浓度作用下,观察LMP-1基因与绿色荧光蛋白共表达的融合重组质粒pEGFP-C3-LMP1在树突状细胞的定向转染.在荧光显微镜下观察荧光蛋白质粒在树突状细胞中的表达,流式细胞仪评价重组质粒的转染效率,台盼蓝染色检测细胞活性.结果 超声辐照机械指数1.0、照射时间60 s、微泡造影剂浓度为20%,达到最佳的基因转染效率(14.37±2.12)%,且细胞生存率>90%.结论 微泡造影剂在超声辐射下可以有效地介导基因转染树突状细胞.     

小鼠骨髓来源树突状细胞培养鉴定和诱导T淋巴细胞增殖

目的:建立一种体外诱导培养小鼠树突状细胞(DCs)的方法,并观察其不同生长阶段生物学形态及刺激淋巴细胞增殖的能力。方法:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,并从形态学、表型及功能方面对其加以检测。结果:用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,3 d后可见细胞形态改变,并呈集簇生长,培养至5 d可见典型的树突状突起,体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DCs,扫描电镜可见典型的树突状细胞形态,高表达骨髓来源DCs特异性标记CD11c和共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ,成熟DC具有很强的刺激同基因型和同种异基因型T淋巴细胞增殖的能力。结论:小鼠骨髓来源的单个核细胞体外诱导培养可生成大量成熟的DCs,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础。     

人骨髓间充质干细胞抑制单核细胞来源的树突状细胞的成熟和功能

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSC)的免疫调节作用以探讨防治异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病(GVHD)的可能途径。方法将培养第5天的人单核细胞来源的树突状细胞(DC)以每孔1×106密度种于24孔培养板,与等体积3~6代MSC上清混合培养48h,加脂多糖(100ng/m l)、肿瘤坏死因子α(TNF-α,10ng/m l)促DC成熟,观察试验组与对照组树突状细胞免疫表型的变化及其分泌细胞因子白细胞介素(IL)-10、IL-12的变化,并通过混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力的变化。结果流式免疫分型显示与对照组相比,树突状细胞成熟表面标志CD83、协同刺激分子CD80表达降低,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-12浓度混合培养组减少41.7%(P<0.05),IL-10浓度无变化,刺激淋巴细胞增殖能力混合培养组降低(P<0.01)。结论骨髓间充质干细胞上清可抑制单核细胞来源的树突状细胞的成熟和功能,诱导免疫耐受。     

人外周血树突状细胞的体外分离、培养和表型鉴定

目的：建立从人外周血分离、纯化、培养树突状细胞的方法，研究细胞因子对树突状细胞体外增殖、分化成熟的影响。方法：取正常人外周血，经淋巴细胞分离液梯度分离，取中间白膜层细胞，通过贴壁处理，获得单个核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）1μg／ml和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）410ng／ml，体外培养7d后，加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）促进其分化成熟。第8天收获悬浮细胞，用相差显微镜和电镜观察其形态，经树突状细胞（DC）单克隆抗体染色后用流式细胞仪进行表型测定。结果：从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF、rhlL-4和TNF-α联合作用1周左右获得大量高纯度树突状细胞，树突状细胞特征：悬浮生长；具有树突状或裙褶状突起；高表达HLA-DR、CD1a、CD80、CD83、CD86和低表达CD14。结论：用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合作用可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞，经形态学观察及表型鉴定得以证实。该培养技术为进一步研究树突状细胞肿瘤疫苗的临床应用奠定了物质基础。     

人肿瘤细胞培养上清对树突状细胞表型和功能的影响

目的：观察肿瘤细胞分泌的可溶性因子对树突状细胞表型和功能的影响，以进一步揭示肿瘤的免疫逃逸机制。方法：体外分离单核细胞，加入白细胞介素4（IL-4)、粒－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）和肿瘤细胞培养上清体外培养树突状细胞，采用流式细胞术、同种异体混合淋巴细胞反应等方法观察肿瘤细胞上清对树突状细胞表型和功能的影响，并用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法检测了免疫抑制因子IL－10、血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子β1（TGF－β1)的mRNA在人结肠、人卵巢和人肝脏肿瘤细胞中的表达。结果：当培养体系中加入人肿瘤细胞培养上清后，树突状细胞表面MHC Ⅱ类分子和CD80等共刺激分子的表达较低，树突状细胞刺激T细胞增殖能力下降，且IL－10mRNA、VEGF、mRNA和TGF－β1 mRNA在3种种瘤细胞中均有不同程度的表达。结论：提示肿瘤细胞培养上清可能抑制树突状细胞的抗原提呈能力，肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子可能是导致肿瘤微环境中的树突状细胞功能低下、机体的免疫系统无法有效激活和启动抗肿瘤免疫反应的原因之一。     

狼疮鼠骨髓树突状细胞的分离培养和免疫学特性

目的对狼疮鼠骨髓树突状细胞进行分离、培养并分析其免疫学特性,为进一步研究和应用狼疮鼠骨髓来源树突状细胞(DC)奠定基础。方法分离、纯化6周龄雄性BXSB狼疮鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/ml重组小鼠白细胞介素-4的RPMI-1640培养基培养,以脂多糖(LPS,1μg/ml)刺激24h体外诱导BXSB狼疮鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞仪分析细胞表面分子,混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞增殖能力。结果经体外诱导培养第2～8天可见大量细胞集落形成,培养的DC具有典型树突状形态,同时DC可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可稳定获得BXSB狼疮鼠骨髓来源DC。     

Mu受体在小鼠树突状细胞中的诱导表达

目的研究Mu受体在小鼠树突状细胞中的诱导表达。方法取7～8周龄的C57BL/6J雌鼠骨髓细胞培养,培养7d后,用CD11c＋磁珠,采用磁性分选的方法纯化树突状细胞。用免疫荧光染色PCR检测Mu受体及其基因在树突状细胞中的表达。并用流式细胞仪对树突状细胞的表型进行分析。结果Mu受体在激活的树突状细胞上有明显（P〈0.05）表达。不同Toll样受体的配体诱导不同程度的Mu受体表达。结论活化的树突状细胞可诱导表达Mu受体。     

OpG ODN对不同来源树突状细胞活化的影响

目的 比较CpG ODN-1826对BALB／C小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)和脾脏来源树突状细胞(SDC)的活化作用。方法 用CpG ODN-1826体外刺激树突状细胞(DC)，流式细胞术检测CD80阳性率，ELISA检测IL-12(p70)分泌水平，MTT法检测活化DC刺激T细胞增殖的能力。结果 CpG ODN-1826体外可不同程度激活BMDC和SDC，诱导DC上调CD80的表达和分泌高水平IL-12，促进DC刺激T淋巴细胞增殖。CpG ODN-1826刺激的BMDC膜表面CD80表达水平明显高于SDC，其分泌IL-12的水平亦高于SDC。结论 CpG ODN-1826可促进小鼠骨髓来源和睥脏来源DC的功能成熟，CpG ODN-1826刺激活化BMDC的作用明显强于刺激活化SDC。     

化学合成siRNA阻断小鼠骨髓源性不成熟树突状细胞GAPDH基因的表达

目的 观察化学合成siRNA在转录后水平降低小鼠不成熟树突状细胞基因表达的效率及其影响因素。方法 体外取小鼠胫骨和股骨的骨髓，分离、培养不成熟树突状细胞，应用化学合成的不同浓度siRNA在LipofectAMINE2000转染试剂介导下转染树突状细胞，流式细胞仪检测siRNA的转染效率，RT-PCR检测小鼠不成熟树突状细胞中GAPDHmRNA水平的变化，锥虫蓝染色测定各组中培养细胞的存活率。结果 转染终浓度为100～600nmol／L的siRNA能特异有效地阻断GAPDH基因的表达，而转染终浓度为50～400nmol／L的siRNA对细胞具有低毒性。结论 siRNA能在不成熟树突状细胞内启动RNA干扰作用，400nmol／L的siRNA能在特异有效地阻断内源性基因表达的同时，最大限度地保持细胞活力。