SW626细胞染色体动粒变异对其染色体不稳定的影响

目的 探讨恶性肿瘤细胞染色体不稳定性的可能机制.方法 采用本实验室建立的kinetochore-NOR同步银染技术,对SW626细胞染色体kinetochore变异进行分析.结果 与正常人外周血细胞相比,SW626细胞染色体kinetochore缺失[132(0.89%) vs 26(0.18%)]、kinetochore迟滞复制[82(0.55%) vs 14(0.10%)]和kinetochore-NOR融合[153(1.03%) vs 51(0.37%)]频率显著升高(P<0.01),而不对称kinetochore频率二者差异性不显著(P>0.05).此外,在某些SW626细胞染色体上还观察到多重kinetochores现象.结论 kinetochore 缺失、kinetochore迟滞复制和kinetochore-NOR融合可能是SW626细胞染色体非整倍性变异起源的诱因之一;染色体多重kinetochores可能是恶性肿瘤细胞染色体结构畸变产生的重要途径之一.     

HADHA通过调节PI3K/AKT信号通路抑制人绒毛膜滋养细胞HTR-8/SVneo迁移与侵袭

  目的  探讨羟酰基辅酶A脱氢酶α亚基（hydroxyacyl-CoA dehydrogenase alpha subunit, HADHA）对人绒毛膜滋养细胞HTR-8/SVneo迁移和侵袭能力的影响及其潜在作用机制。  方法  通过组织免疫荧光染色检测HADHA在6～8周正常早孕绒毛及复发性自然流产绒毛样本中表达水平的差异;慢病毒系统构建HADHA过表达及敲低稳转HTR-8/SVneo细胞系,并采用qRT-PCR、Western blot、Transwell、细胞划痕实验评价HADHA对HTR-8/SVneo细胞迁移侵袭能力和相关基因表达的影响;转录组测序及生物信息学分析筛选HADHA可能调控的靶基因及信号通路;加入蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）抑制剂明确HADHA调节HTR-8/SVneo细胞迁移侵袭的具体分子机制。  结果  HADHA在复发性自然流产样本的绒毛外滋养层（extravillous trophoblast, EVT）中较正常对照组中高表达。过表达HADHA的HTR-8/SVneo细胞中迁移侵袭相关基因HLA-G、MMP2、MMP9、NCAD的表达水平降低（P<0.01,P<0.05）,且迁移和侵袭能力减弱（P<0.05）;敲低HADHA后,基因HLA-G、MMP2、MMP9、NCAD的表达水平增高（P<0.01,P<0.05）,且迁移和侵袭能力增强（P<0.05）。此外,过表达HADHA后p-PI3K、p-AKT水平降低（P<0.05）,PI3K/AKT信号通路被抑制;敲低HADHA后PI3K/AKT信号通路被激活。在HADHA敲低稳转细胞系中加入AKT抑制剂MK-2206后,细胞迁移侵袭能力较对照敲低组减弱（P<0.01,P<0.05）。  结论  HADHA通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移与侵袭。     

hsa-miR-200a对HEC-1B人子宫内膜腺癌细胞系增殖与凋亡的影响

目的探讨hsa-miR-200a对人子宫内膜腺癌HEC-1B细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法应用荧光实时定量PCR(FQ-PCR)法检测hsa-miR-200a在人子宫内膜腺癌细胞HEC-1B中的表达水平;人工合成hsa-miR-200a模拟物、抑制剂,分别转染HEC-1B细胞;采用MTT法、流式细胞仪检测上调及抑制hsa-miR-200a的表达对HEC-1B细胞增殖活性与凋亡的影响;运用生物信息学分析hsa-miR-200a指向的与增殖和凋亡相关的靶基因;Western blot、FQ-PCR检测转染前后靶蛋白及其mRNA的表达水平。结果子宫内膜腺癌细胞HEC-1B表达hsa-miR-200a;FQ-PCR检测hsa-miR-200a模拟物、抑制剂转染HEC-1B细胞成功;MTT法检测结果表明hsa-miR-200a抑制剂转染组中细胞增殖抑制明显;流式细胞仪检测结果表明hsa-miR-200a抑制剂转染组中细胞凋亡增加;生物信息学分析结果表明hsa-miR-200a调控的靶基因是SON、Pdcd4、磷酸酶-张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN);靶蛋白PTEN在转染模拟物组表达下调,抑制剂组中表达上调,且转染前后靶基因mRNA水平无显著变化,而蛋白SON、Pdcd4的表达量没有显著变化。结论 HEC-1B细胞中hsa-miR-200a表达与PTEN蛋白表达呈负相关,表明hsa-miR-200a可能通过调节PTEN蛋白表达水平从而影响HEC-1B细胞的增殖与凋亡。     

Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜中的表达

目的：检测Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜组织中的表达规律,为阐明其在胚胎着床中的作用打下基础。方法：利用实时荧光定量PCR、免疫组化和Western blot分别检测未孕、假孕及孕d1~d7小鼠子宫内膜中Dicer基因mRNA和蛋白质的表达。结果：在小鼠着床窗期及着床后（d4～d7）,小鼠子宫内膜中Dicer基因mRNA和蛋白质表达均明显升高,d5达到高峰（PmRNA=0.000,P蛋白= 0.000）;且Dicer表达主要定位于子宫内膜基质细胞。结论：Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜组织中的表达存在时间与空间差异,这种规律性表达所调控的细胞生长、增殖和分化可能是胚胎正常着床的分子机制之一。     

重庆市主城区早孕期妇女叶酸与出生缺陷预防认知调查

目的了解旱孕期妇女对叶酸、出生缺陷认知度，促进早孕期妇女对出生缺陷预防的认识。方法采用问卷形式对重庆市主城区147名正常早孕期妇女进行调查，随机抽取96名参加血清叶酸值测定。结果参与调查的早孕期妇女，叶酸知晓率为88．4％；68人（46．3％）能够正确选择“叶酸的功能”选项；123人（83．7％）知道胚胎发育早期体内叶酸缺乏可能会影响胎儿神经系统的发育；21人（14．3％）选择会在孕期全程服用叶酸，有24人（16．3％）一直未服用。16人（10．0％）接触了射线、噪声、化学制剂等有害环境因素；9人（6．1％）在孕期服用了药物；9人（6．1％）在饮食或生活习惯上对胎儿发育不利。神经管畸形认知度调查结果显示，59人（40．1％）清楚神经管畸形的类型包括无脑儿、脑积水和脊柱裂；74人（52．1％）认为怀孕时体内缺乏叶酸是神经管畸形发生的可能原因。96名参加血清叶酸值测定结果显示，无叶酸缺乏者，其统计均值为（26．34&#177;9．81）ng／mL。结论早孕期妇女对出生缺陷预防的认识有待进一步提高。     

重庆市主城区早孕期妇女叶酸与出生缺陷预防认知调查

目的 了解早孕期妇女对叶酸、出生缺陷认知度,促进早孕期妇女对出生缺陷预防的认识.方法 采用问卷形式对重庆市主城区147名正常早孕期妇女进行调查,随机抽取96名参加血清叶酸值测定.结果 参与调查的早孕期妇女,叶酸知晓率为88.4%;68人(46.3%)能够正确选择"叶酸的功能"选项;123人(83.7%)知道胚胎发育早期体内叶酸缺乏可能会影响胎儿神经系统的发育;21人(14.3%)选择会在孕期全程服用叶酸,有24人(16.3%)一直未服用.16人(10.0%)接触了射线、噪声、化学制剂等有害环境因素; 9人(6.1%)在孕期服用了药物;9人(6.1%)在饮食或生活习惯上对胎儿发育不利.神经管畸形认知度调查结果显示,59人(40.1%)清楚神经管畸形的类型包括无脑儿、脑积水和脊柱裂;74人(52.1%)认为怀孕时体内缺乏叶酸是神经管畸形发生的可能原因.96名参加血清叶酸值测定结果显示,无叶酸缺乏者,其统计均值为(26.34±9.81)ng/mL.结论 早孕期妇女对出生缺陷预防的认识有待进一步提高.     

mmu-miR-141在早孕小鼠胚胎着床前、后子宫内膜中的表达及作用

目的:探讨mmu-miR-141在早孕小鼠胚胎着床前、后子宫内膜组织中的表达及作用。方法:荧光定量PCR(FQ-PCR)及原位杂交检测早孕小鼠胚胎着床前、后子宫内膜mmu-miR-141的表达;MTT和流式细胞术检测孕第4日(d 4)子宫内膜基质细胞被mmu-miR-141抑制剂作用72 h后其细胞活力和细胞凋亡情况。结果:mmu-miR-141在小鼠胚胎着床后(d 6)子宫内膜组织中的表达明显低于着床前(d 4)(P<0.05),且表达于基质细胞;其表达下调能使基质细胞增殖活力下降(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.01)。结论:mmu-miR-141通过调控子宫内膜基质细胞的增殖或凋亡,在早孕小鼠胚胎着床前、后的子宫内膜组织中发挥重要的作用。     

米非司酮对小鼠着床期子宫内膜活化的β-连环蛋白(active β-catenin)表达的影响

目的:探讨活化的β-连环蛋白(active β-catenin)在胚胎着床过程中的作用。方法:将孕第2日(d2)昆明小鼠随机分成3组,每组30只,A组:孕d2单次背部皮下注射0.1ml米非司酮(1.2mg/ml);B组(溶剂对照):以等量1,3-丙二醇代替米非司酮;C组:不作任何处理。用免疫组织化学、间接免疫荧光、Western blotting方法定性、定量、定位检测3组小鼠在妊娠d3￣7活化的β-连环蛋白的动态表达。结果:B、C组小鼠子宫内膜中活化的β-连环蛋白于孕d3在腺上皮和腔上皮、基质细胞质和细胞膜表达;妊娠d4在腔上皮细胞质和细胞膜强表达,并达高峰;妊娠d5￣7在腺上皮、血管内皮、腔上皮下基质细胞膜和细胞质表达,且B、C组间在妊娠d3￣7各时间点的表达无显著性差异(P>0.05);A组小鼠妊娠d3￣7活化的β-连环蛋白的表达较B、C组显著降低(P<0.01),在妊娠d4表达量未见高峰,且表达部位局限于基质细胞,腔上皮无表达。结论:米非司酮可能通过抑制孕激素与其受体结合而下调活化的β-连环蛋白表达,进而抑制子宫内膜黏附性,影响子宫内膜容受性的建立而阻碍胚胎顺利着床。     

双酚A暴露经DNA甲基化途径影响滋养细胞功能的机制探讨

【目的】 本研究采用双酚A(bisphenol A,BPA)暴露的人滋养细胞模型(绒毛外滋养层细胞系HTR-8和合体化滋养层细胞系Bewo),分析滋养细胞分化及功能相关的重要基因的甲基化修饰及相应基因表达的改变,探索BPA暴露对滋养细胞的影响,从而为BPA高暴露人群提供科学的优生和生殖健康指导。 【方法】 蛋白质印迹法检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GCM-1、systin-1等蛋白的表达;免疫荧光检测蛋白表达与定位;甲基化测序(BGS)验证DNA甲基化差异基因;Transwell实验检测滋养细胞侵袭能力;RT-PCR检测滋养细胞功能相关基因mRNA水平。 【结果】 粘附相关标志蛋白E-cadehrin在人滋养细胞侵袭模型HTR-8滋养细胞系中弱表达,其编码基因CDH1基因启动子呈超甲基化状态。BPA暴露后,E-cadherin的表达随BPA浓度增加呈梯度上调, 侵袭能力标志蛋白N-cadherin的表达呈梯度下调。Transwell实验显示HTR-8细胞的侵袭能力随BPA浓度增加而逐渐减弱;重亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequence,BSP)结果显示,BPA暴露后人基因组长重复序列LINE-1甲基化程度明显减少,人基因组短重复序列ALU甲基化程度无明显变化。蛋白质印迹和免疫荧光结果显示, BPA暴露的人滋养细胞合体化模型Bewo细胞系中,合体化标志蛋白systin-1和GCM-1的表达随BPA浓度增加而逐渐减弱。 【结论】 BPA暴露可使人滋养细胞侵袭模型HTR-8细胞系中粘附、侵袭相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达分别上调和下调,合体化模型Bewo细胞系中功能相关蛋白表达降低,这表明随BPA浓度增加,HTR-8细胞侵袭能力逐渐减弱,Bewo细胞合体化能力也逐渐减弱;伴随人基因组长重复序列LINE-1甲基化程度明显降低。研究结果显示,BPA可能通过DNA甲基化途径影响人滋养层细胞侵袭和合体化功能。