PTEN基因对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT通路的影响

 【目的】探讨PTEN基因在子宫内膜癌PI3K/AKT通路中的作用,评估PTEN基因在抗肿瘤治疗中的意义。【方法】利用慢病毒载体系统, 构建人PTEN基因RNA干扰慢病毒载体和PTEN基因过表达慢病毒载体,分别转染PTEN野生型的HEC-1A细胞和PTEN突变型的Ishikawa细胞, 建立PTEN 基因敲减及过表达的细胞模型,Western Blot方法检测PTEN基因敲减或过表达前后PTEN蛋白的表达和AKT通路的活化情况, MTT法检测慢病毒转染前后细胞增殖的变化,流式细胞术检测慢病毒转染前后细胞周期及细胞凋亡率的变化。【结果】1. HEC-1A细胞转染PTEN基因干扰慢病毒载体后,细胞的增殖曲线和细胞凋亡率与对照组比较无明显变化。但Ishikawa细胞转染PTEN基因过表达慢病毒载体后,增殖曲线和细胞凋亡率显示其生长呈明显抑制状态。2.当HEC-1A细胞转染了RNA干扰病毒后（HEC-1A-RNAi）,Western Blot 结果显示PTEN蛋白表达下调,其EGFR, p-EGFR, mTOR, p-mTOR, AKT, p-AKT蛋白表达增强,当Ishikawa细胞转染了过表达载体病毒后（Ishikawa-PTEN）,Western Blot 结果显示其PTEN蛋白表达上调,p-EGFR,p-mTOR,AKT,p-AKT蛋白表达减弱。3.HEC-1A-RNAi细胞周期中G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,Ishikawa-PTEN细胞周期中G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少。【结论】PTEN 基因可以抑制细胞增殖过程, 有可能成为子宫内膜癌患者基因治疗的选择之一。     

Hsa-miR-193b抑制人子宫内膜腺癌细胞株HEC-1B侵袭能力

目的探讨Hsa-miR-193b对人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1B侵袭的影响及其相关机制。方法将Hsa-miR-193b模拟物(mimics)、Hsa-miR-193b抑制剂(inhibitor)转染HEC-1B细胞,Real-time PCR证实转染是否成功;Transwell小室法检测转染Hsa-miR-193b mimics后HEC-1B细胞的侵袭能力;通过miRGen、Targetscan、Pictar数据库筛查Hsa-miR-193b指向与侵袭相关的靶基因;Real-time PCR检测转染Hsa-miR-193b mimics转染组和对照组mRNA水平;Western blot检测各组GRB7蛋白表达的水平。结果①Hsa-miR-193b mimics、Hsa-miR-193b inhibitor转染HEC-1B细胞成功,两转染组Hsa-miR-193b表达水平与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.05)。②转染Hsa-miR-193b mimics组与对照组比较,肿瘤细胞的侵袭能力明显降低(P<0.05)。③转染后,靶基因GRB7蛋白Hsa-miR-193b mimics组表达下降(P<0.05)、Hsa-miR-193b inhibitor组表达增加(P<0.05),且各组GRB7 mRNA水平无显著变化。结论在HEC-1B中转染Hsa-miR-193b mimics能下调GRB7蛋白表达,并抑制HEC-1B细胞的侵袭。     

曲古霉素A对人子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖和凋亡的作用及相关机制

【目的】探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(trichostatin A,TSA)对人子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖和凋亡的作用及其可能机制。【方法】应用不同浓度的TSA处理子宫内膜癌HEC-1B细胞72 h,Western blotting法检测细胞内组蛋白H4乙酰化水平及p21蛋白,荧光定量PCR方法检测p21基因mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率。【结果】经TSA作用后,人子宫内膜癌HEC-1B细胞内组蛋白H4乙酰化水平增加,p21基因mRNA及蛋白表达增加;同时细胞生长受到抑制,细胞凋亡增加。【结论】TSA通过提高组蛋白乙酰化水平,增加p21基因表达,抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的增殖和诱导细胞凋亡。     

miR-449b通过E2F3-p53途径抑制子宫内膜腺癌细胞HEC-1-B的生长

目的 探讨miR-449b对子宫内膜腺癌细胞HEC-1-B增殖和凋亡的影响及其作用的分子途径。 方法 脂质体lipofectamine 2000包被miR-449b并转染入HEC-1-B细胞,实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miR-449b的表达水平,CCK-8试验检测转染前后细胞活性,流式细胞仪来检测转染前后细胞凋亡情况。细胞克隆形成实验观察转染前后细胞克隆形成能力。Western blot方法检查转染前后细胞内E2F3蛋白和p53的表达情况。 结果 转染后实验组miR-449b表达量较NC组增加,细胞增殖能力和克隆能力减弱,而细胞凋亡增加(P<0.05)。miR-449b使E2F3表达下调,p53表达上调(P<0.05)。 结论 miR-449b通过E2F3-p53途径抑制HEC-1-B细胞增殖并促进凋亡,可能作为治疗子宫内膜腺癌的新分子靶标。     

塞来昔布对人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1B增殖和凋亡的影响

目的探讨环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1B增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度塞来昔布作用HEC-1B细胞后细胞增殖的变化;不同浓度塞来昔布作用HEC-1B细胞24 h后,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;RT-PCR检测细胞中COX-2 mRNA的表达。结果MTT结果显示,塞来昔布对HEC-1B细胞的增殖抑制作用呈现时间依赖性和浓度依赖性;不同浓度塞来昔布作用HEC-1B细胞24 h后,流式细胞仪结果显示G0/G1期细胞增加,S期和G2/M细胞减少,细胞凋亡率增加,各药物组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果显示,在50~200μmol/L塞来昔布组,随着药物浓度的增加COX-2 mRNA的表达逐渐减弱(P<0.05)。结论塞来昔布能抑制HEC-1B细胞的增殖,并能改变细胞周期和诱导凋亡,其机制可能与下调细胞中COX-2 mRNA的表达有关。     

塞来昔布对人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1B增殖和凋亡的影响

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1B增殖及凋亡的影响及其作用机制.方法 噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度塞来昔布作用HEC-1B细胞后细胞增殖的变化;不同浓度塞来昔布作用HEC-1B细胞24 h后,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;RT-PCR检测细胞中COX-2 mRNA的表达.结果 MTT结果显示,塞来昔布对HEC-1B细胞的增殖抑制作用呈现时间依赖性和浓度依赖性;不同浓度塞来昔布作用HEC-1B细胞24 h后,流式细胞仪结果显示G0/G1期细胞增加,S期和G2/M细胞减少,细胞凋亡率增加,各药物组与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);RT-PCR结果显示,在50 ～ 200 μmol/L塞来昔布组,随着药物浓度的增加COX-2 mRNA的表达逐渐减弱(P＜0.05).结论 塞来昔布能抑制HEC-1B细胞的增殖,并能改变细胞周期和诱导凋亡,其机制可能与下调细胞中COX-2 mRNA的表达有关.     

RNA干扰抑制HMGB1基因表达对子宫内膜癌的增殖抑制作用及其分子机制

目的：研究RNA干扰抑制高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的表达对子宫内膜癌 细胞株HEC-1A的增殖抑制作用及对细胞周期、细胞凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制。方法：构建靶向HMGB1 基因的慢病毒shRNA载体,转染子宫内膜癌细胞株HEC-1A,同时利用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹检测转染 HMGB1-siRNA后细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT法和流式细胞术分别检测转染HMGB1-siRNA后 HEC-1A细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化。Western印迹检测转染HMGB1-siRNA后细胞AKT,pAKT和cyclinD1 的蛋白表达水平。结果：慢病毒HMGB1 shRNA载体成功抑制HMGB1 mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)在HEC-1A细胞 中的表达;转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的增殖能力明显受抑制(P<0.01),并能阻滞细胞于G0/G1期,且明显 诱导细胞凋亡;转染HMGB1 shRNA组、空白对照组和阴性对照组的总凋亡率分别为(17.89±0.23)%,(4.69±0.20)%和 (4.62±0.17)%,3组之间差异有统计表达学意义(P<0.01)。转染HMGB1 shRNA后细胞pAKT和cyclinD1蛋白表达水平均下 调(均P<0.01)。结论：HMGB1表达下调可以有效地抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖,细胞阻滞于G0/G1期,且可诱 导细胞凋亡,影响磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路及下调cyclinD1的蛋白表达水平可能为其主要作 用机制。     

两株子宫内膜癌细胞中mTOR信号通路激活的研究

目的：探讨PTEN缺失Ishikawa和PTEN完整HEC-1A细胞中mTOR信号通路的激活。方法：激光共聚焦显微镜检测Ishikawa和HEC-1A细胞中PTEN蛋白表达；RT-PCR和western blot法从mRNA和蛋白水平分别检测mTOR mRNA和下游磷酸话靶蛋白S6K1和4E-BP1表达。结果：Ishikawa细胞中PTEN蛋白表达缺失，HEC-1A细胞PTEN蛋白表达显著 (P<0.01)；两株细胞中均存在mTOR mRNA表达，而Ishikawa细胞中表达水平要高于HEC-1A细胞(P<0.05)；Ishikawa细胞中S6K1和4E-BP1蛋白的磷酸化要明显高于HEC-1A细胞(P<0.05)。 结论：2种子宫内膜癌细胞中均存在mTOR信号通路的激活，这种激活水平与PTEN相关，PTEN缺失Ishikawa细胞的激活水平较高。 【关键词】子宫内膜癌；雷帕霉素靶蛋白；PTEN；Ishikawa细胞；HEC-1A细胞     

KCC1基因在IGF-Ⅰ调控子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖中作用的研究

目的 探讨胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖能力的影响,以及KCC1基因在IGF-Ⅰ调控子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖中的作用.方法 应用IGF-Ⅰ处理子宫内膜癌HEC-1B细胞,RT-PCR检测HEC-1B细胞中KCC1基因的表达,MTT比色法和流式细胞术检测HEC-1B细胞增殖能力和细胞周期的改变.设计并合成KCC1基因特异性的siRNA,转染HEC-1B细胞,检测RNA干扰后HEC-1B细胞的增殖能力及细胞周期的变化.结果 IGF-Ⅰ能够明显增加HEC-1B细胞中KCC1基因的表达,而且能够促进细胞增殖分裂.KCC1基因特异性的siRNA能够明显抑制HEC-1B细胞中KCC1基因的表达(P<0.05).KCC1表达下调的HEC-1B细胞的增殖能力出现明显下降(P<0.05),细胞周期分析显示实验组细胞明显阻滞于G0/G1期(P<0.05).结论 IGF-Ⅰ能够促进子宫内膜癌HEC-1B细胞的增殖,KCC1基因参与了该调控过程,抑制KCC1基因的表达能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖能力.     

PTEN基因对K562细胞增殖、凋亡及对Bcl-2和Caspase家族的影响

目的 探讨肿瘤抑制基因PTEN对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的增殖、凋亡及对凋亡相关基因Bcl-2及Caspase-3/7及-9的影响.方法 将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)转染人慢性粒细胞白血病K562细胞系.通过MTT检测细胞生长曲线,流式细胞仪分析转染效率、细胞凋亡率和细胞增殖指数,同时观察光镜、电镜下细胞形态,DNA ladder、荧光染色等方法检测细胞凋亡,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN及Bcl-2 mRNA水平变化,Western Blotting检测PTEN及Bcl-2蛋白变化,应用试剂盒检测Caspase-3/7及-9蛋白活性.结果 以感染复数为200的Ad-PTEN-GFP 转染K562细胞后,最大生长抑制率为37.1%,早期和中晚期凋亡率均高于转染Ad-GFP组和未转染组(P＜0.05),转染PTEN基因3 d后Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平分别是Ad-GFP组的0.27倍和 0.58倍,Caspase-3/7及-9蛋白活性在转染PTEN基因后3 d内呈时间依赖性升高.结论 过表达PTEN基因可能通过抑制抗凋亡分子Bcl-2表达,增强Caspase-3/7及-9活性从而抑制K562细胞系增殖,促进细胞凋亡.